皮油沉香基本特征及品质分析△

冯剑，刘培卫，杨云，欧阳冬青，刘洋洋，2*，魏建和，2*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所/海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室，海南 海口 570311；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193

沉香为瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria和拟沉香属Gyrinops植物的含有树脂的木材，是名贵药材和香料[1-2]。晋代《南方草木状》[3]及唐代《新修本草》[4]均记载：“蜜香、沉香、鸡骨香、黄熟香、栈香、青桂香、马蹄香、鸡舌香，按此八物，同出一树也……其根、干、枝、节各有别色也。细枝紧实未烂者，为青桂香”。青桂香即为树枝(青色树皮)形成的沉香。不同部位结香种类可分为“四名十二状”，青桂香属于生结沉香，称其为皮油”。

沉香一般是在茎、根、枝的木质部中形成，树皮很薄，占比不大，易干枯或腐烂，很少形成沉香，因此，皮油现存量很少，一般认为一旦形成其品质较好，比较独特。目前仅有对海南产皮油沉香挥发性成分进行了GC-MS初步分析，发现含倍半萜成分较多[5]，但国内外对皮油沉香结构、物种基原、品质评价等方面的科学研究未见报道。因此，本文从皮油沉香形态特征、显微结构、物种基原及化学成分进行分析，旨在科学的认识和利用皮油沉香，为其鉴定和品质评价提供技术支撑。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

本实验的材料是从市场上收集到典型的皮油沉香样品(PC01、PC02、PC03)3份，以通体香沉香TC01(通体结香技术生产)1份和板头香沉香BC01(全断杆法生产)1份作为对照(图1)。经中国医学科学院药用植物研究所海南分所刘洋洋副研究员鉴定，均为含有树脂的沉香木材，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所海南分所沉香鉴定中心标本馆。

图1 实验用沉香样品

1.2 仪器

PCR仪(Bio-Rad，美国)；核酸定量分析仪(Nanodrop 2000，美国Thermo)；台式高速冷冻离心机(MIKRO 220R，德国 Hettich)；凝胶成像仪(SC910，杭州得聚仪器设备有限公司)；电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)；气相色谱质谱联用仪(7890A-5975C，美国 Agilent)；高效液相色谱仪(1525，美国Waters)；生物显微镜(Eclipse，日本NiKon)；电子天平(LE104E，瑞士Mettler Toledo)；超声波清洗仪(PS-40，深圳市洁威超声波)；HP-5MS% Phenyl Silox(30 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管。

1.3 试剂

HP Plant DNA Kit(50)试剂盒(OMEGA)；引物(华大基因)；2×EasyTaqPCR SuperMix(-dye)(Trans Gen)；琼脂糖(Biowest agarose)；Marker D2000(中科瑞泰)；沉香对照药材(121222-201203)和沉香四醇对照品(111980-201601，纯度96.8%)购自中国食品药品检定研究院；乙腈为HPLC级，异丙醇、β-巯基乙醇为优质级，乙醚、无水乙醇和95%乙醇等均为分析级。

2 方法

2.1 感官评价方法

对收集的皮油沉香样品，从外观形态(形状、断面、皮部特征)、色泽、油性、气味及树脂(醇溶性浸出物)含量等方面进行评价。

2.2 显微结构观察

取沉香样品切成方块状，置于包埋盒中，水浴煮至柔软，经软化、切片和透明，采用徒手滑走切片，再经水合氯醛溶剂透化后，在生物显微镜下观察样品切面结构。

2.3 物种鉴定

2.3.1 DNA提取 取沉香干燥样品，刮去表面的杂质，用75%的酒精棉球擦拭样品表面，晾干后用无菌刀片切碎样品，称取0.10 g，放置在2 mL的离心管中，充入液氮，高通量组织研磨仪中研磨2 min。用改良的OMEGA HP plant DNA提取试剂盒提取DNA，加入1000 μL预热的CPL和10 μL的β-巯基乙醇，温浴，其余步骤按照试剂盒说明书操作。测定总DNA的浓度，并计算OD260与OD280的比例，并将提取的DNA保存于-20 ℃冰箱，备用。

2.3.2 PCR扩增和电泳检测 PCR体系总体积为25 μL，其中包含：2×EasyTaqPCR SuperMix(-dye)(+dye)12.5 μL、DNA模板2 μL、引物各1 μL，dd H2O 8.5 μL。引物采用通用引物ITS2(ITS2-F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT)。PCR仪扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍照记录分析。

2.3.3 PCR产物测序及序列数据分析 PCR产物直接使用测序仪进行双向测序，序列拼接软件CodonCode Aligner V3.7.1 对测序峰图进行拼接，去除引物区及低质量序列；基于隐马尔科夫模型(HMMs)，去除5.8 s和26 s区域获得ITS2序列。从GenBank数据库中搜集并下载沉香属ITS2序列，整合处理后结合样品序列，进行二级结构的比较，并建立NJ和MP系统发育树，分析沉香与其同属沉香的亲缘关系。

2.4 化学成分分析

2.4.1 挥发性成分分析

2.4.1.1 样品制备 取0.20 g沉香样品粉末加入乙醚溶剂超声提取3次(5 mL/次)，每次超声15 min，静置5 min后0.22 μm过滤得到乙醚提取液，合并滤液，自然挥干后得到5份沉香样品的油状提取物(提取得率分别16.5%、4.0%、11.8%、10.2%、8.2%)，气味芳香，香味独特、浓郁。加乙醚溶解后GC-MS进样分析。

2.4.1.2 色谱条件 1)色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱(5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm，0.25 μm)；2)升温程序：柱温50 ℃，保持1 min，以15 ℃·min-1升温至140 ℃并保持1 min，然后以1 ℃·min-1升至160 ℃并保持2 min，最后以15 ℃·min-1升至250 ℃，进样口温度240 ℃；3)载气为高纯He，载气(He)流速1.0 mL·min-1，进样量1 μL；4)分流比20∶1，溶剂延迟时间4 min；5)电子轰击(EI)离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度260 ℃，质量扫描范围40～300m/z。

2.4.1.3 化合物鉴定 样品经GC-MS分析后，通过MSD化学工作站，结合NIST11质谱图库对各组分质谱数据进行检索与定性，并按峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

2.4.2 沉香特征图谱及沉香四醇含量测定

2.4.2.1 样品制备 取沉香四醇对照品，精密称定，用95%乙醇溶解制成60 μg·mL-1溶液。精密称定沉香样品粉末0.20 g，置具塞锥形瓶中，精密加入10 mL 95%乙醇，称定质量，浸泡0.5 h，超声处理1 h，放冷后称定质量，用95%乙醇补足减失质量，摇匀，静置，取上清滤液，即得。

2.4.2.2 色谱条件 参照《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)方法，选用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱条件。流速0.7 mL，柱温30 ℃，检测波长为252 nm[6]。

(2)粉煤灰吹填施工。相较于其他的填土材料，粉煤灰有着超强的透水性。使用这种材料能够降低填土费用，并且利用其超强的透水性能够加速吹填土的凝固。具体应用时要将粉煤灰和淤泥根据一定比例混合吹填，保证均匀吹填，从而改善土层固结特性。

3 结果与分析

3.1 沉香样品感官特征

皮油沉香市场现存量低，对市场上购置的3批典型皮油沉香(PC01、PC02和PC03)进行感官特征评价，并以通体香沉香(TC01)和板头香沉香(BC01)作为对比(表1)。皮油沉香外观形状多呈不规则的片块，纤维多，外皮可见角质化的皮组织，内皮层色泽较深可见棕色树脂，质地柔软或较硬，具有清凉或甜蜜香味，醇溶性浸出物含量符合《中国药典》规定。

表1 沉香样品感官特征

注：—表示产地不明确。

3.2 沉香显微结构

3批皮油沉香样品显微结构显示(图2)，皮油沉香PC01与通体香沉香TC01、板头香沉香BC01样品横向切面(A1、A4、A5)具有典型的木间韧皮部、射线和导管等沉香显微结构，径向切面(B1、B4、B5)及切向切面(C1、C4、C5)也可以观察到明显的射线和导管。但皮油沉香PC02、PC03样品的横向切面、径向切面显微结构明显不同于典型的沉香特征结构，韧皮纤维发达，射线多呈束，壁稍厚，不规则排列，木间韧皮部与射线交联，呈棕色至棕黄色。韧皮薄壁细胞多成不规则，细胞径向延长，部分被纤维隔断成不规则。射线宽1至多列细胞，充满树脂。

注：A、B及C分别为横向切面、径向面和切向切面；1～3为3批皮油沉香样品；4为通体香沉香；5为板头香沉香；P为韧皮部；IP为木间韧皮部；XR为射线；V为导管。图2 沉香样品显微结构

3.3 沉香样品物种鉴定

对5批沉香样品进行DNA提取，PCR扩增产物凝胶电泳图见图3。经去除5.8 s和26 s区域获得ITS2片段序列的实际长度为230 bp，3批皮油沉香样品的GC质量分数分别为57.39%、57.83%和57.83%，与GenBank数据库的沉香属AquilariaLam.物种的ITS2序列进行比对，进行ITS2二级结构预测及比对(Schultz et al.，2006)，3批皮油沉香样品的二级结构见图4所示，ITS2 二级结构与白木香Aquilariasinensi(Lour.)Gilg(GI238696002)一致，E-value为4.875 285 235 088 5e-119，ITS2二级结构均含有螺旋(Helix)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ。其中，螺旋Ⅱ结构最稳定，包含有CCGU和UGG的图案结构。ITS2序列NJ和MP聚类树拓扑构型基本一致(图5、图6)，Bootstrap重复1000次，枝上数值显示自展率为≥50%。在构建的NJ和MP聚类树中3批皮油沉香、通体香沉香和板头香沉香样品均与A.sinensis聚成一支，自展支持率分别为84%和86%。由NJ树和MP树可以明确3批皮油沉香样品的基原为白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg。此外，对物种进行种内种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离分析表明，皮油沉香样品与A.sinensis的遗传距离最近。

图3 沉香样品PCR扩增电泳图

图4 皮油沉香ITS2二级结构

图5 基于ITS2序列构建的沉香样品NJ树

图6 基于ITS2序列构建的沉香样品MP树

3.4 沉香GC-MS成分分析

不同沉香样品乙醚提取物GC-MS总离子流图有明显差异，见图7。3批皮油沉香样品的乙醚萃取物检测到倍半萜类成分分别为36、27和29；通体香沉香和板头香沉香的乙醚提取物中倍半萜类成分为22和30种。对35种倍半萜类化合物和5种特殊的芳香族化合物进行比对分析(表2)。其中皮油沉香与通体香沉香、板头香沉香样品中共有的成分为苄基丙酮(4-phenyl-2-butanone)、α-檀香醇(α-santalol)、沉香螺旋醇(agarospirol)。其中，沉香螺旋醇为沉香的特征性成分，已有文献报道[11]。此外，3批皮油沉香样品间的化学成分差异也较大，皮油沉香与通体香沉香和板头香沉香的气味有所差异，也可能是含有这些特殊的成分所致。

注：A、B、C为3批皮油沉香；D为通体香沉香；E为板头香沉香。 图7 沉香样品乙醚提取物GC-MS总离子流图

表2 沉香样品挥发性成分及其相对质量分数

注：—表示未检出。

3.5 沉香特征图谱及沉香四醇含量

3批皮油沉香的特征图谱均与通体香沉香和板头香沉香呈现的6个特征峰与《中国药典》规定的一致，且峰1为沉香四醇(图8)。PC01、PC02、PC03、TC01和BC01的沉香四醇质量分数分别为75.937(0.38%)、44.398(0.22%)、374.176(1.87%)、125.561(0.62%)、63.567 μg·mL-1(0.32%)。3批皮油沉香样品沉香四醇含量均符合《中国药典》规定的含量限值不得低于0.1%，其中皮油沉香PC03的含量最高。

4 结论与讨论

4.1 皮油沉香基本特征及定义

皮油沉香外观较为特殊，目前皮油沉香市场现存量极低，在野外也不易获取，有学者认为皮油沉香是指白木香树皮受伤，汁液泛出，在树皮处所结的沉香[5]。针对皮油沉香并未有明确的定义，本研究从市场上收集了3批较为典型的皮油沉香样品，经DNA条形码鉴定基原为白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.，同时对其进行了外观形态形征及微观结构初步描述。皮油沉香外观形状多呈不规则的片块，外皮可见角质化的皮组织斑块，内皮层色泽较深可见棕色树脂斑点或条带，纤维多，多呈棕黄色(图9)，质地柔软或较硬，一般具有清凉或甜蜜花香味。市场上也有常见的火烧树的方法形成的薄片状的沉香，结香面在内侧，易与皮油沉香相混淆。3批皮油沉香样品中，只有1批符合典型的沉香特征结构，2批皮油沉香样品的横向切面、径向切面显微结构明显不同于典型的沉香特征结构，但皮油沉香显微结构特点为韧皮纤维发达，射线多呈束，壁稍厚，不规则排列，木间韧皮部与射线交联，呈棕色至金黄色。韧皮薄壁细胞多成不规则，细胞径向延长，部分被纤维隔断成不规则。射线宽1至多列细胞，充满树脂。

注：A为中检院沉香对照药材；B、C、D为3批皮油沉香；E为通体香沉香；F为板头香沉香。图8 沉香样品HPLC特征图谱

因此，结合皮油沉香的宏观形态和微观显微结构，课题组提出了皮油沉香的定义，可供业内参考：皮油沉香(agarwood‘bark’)为瑞香科沉香属植物树皮至形成层之间的组织(有些也包含了部分木质部组织)，受到外界因素的伤害形成的含有树脂的木材。外侧具有明显的角质化皮组织斑块，内侧色泽较深可见棕色树脂斑点或条带，断面纤维众多。

图9 皮油沉香样品宏观结构

4.2 皮油沉香化学成分与品质特征

此外，皮油沉香与通体香沉香和板头香沉香的气味有所差异，可能是含有特殊的芳香族成分引起，皮油沉香PC01样品中含有似松木树脂及温和木香气味的异松油烯，也含有可作为定香剂的成分氢化肉桂酸，皮油沉香PC02样品中含有具有玫瑰花香的苄丁醚，皮油沉香PC03样品中含有具芳香气味的对二甲苯，这些成分可使皮油沉香，具有香气清凉，散发花香、蜜香气味。