不同厂家胰酶制备鸡胚成纤维细胞对比试验

陈淑亚 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

细胞是生命体的组成和架构的最小单位，是生命科学研究的重要工具。细胞培养广泛地应用于生物工程领域例如病毒的分离、鉴定，疫苗制备以及筛选各类毒株[1]。随着生物学研究工作的发展，鸡胚成纤维细胞应用越来越广泛。因为鸡胚成纤维细胞来源方便，适应能力强，繁殖快，耐受性良好等特点，被广泛应用于生物制品领域，比如病毒培养、疫苗制备、各实验室的基础细胞等。因此鸡胚成纤维细胞培养工作越来越受到重视，采用不同厂家生产的胰酶对SPF鸡胚进行消化培养，通过活细胞计数和贴壁培养观察细胞的生长情况[2]。

1 材 料

1.1 试验材料及其他 鸡胚：9～11日龄SPF鸡胚购于济南斯帕斯家禽有限公司。主要器械：吸管、平皿、T25方瓶、眼科镊、眼科剪、镊子、蛋托、搪瓷罐、水浴锅、倒置显微镜、CO2培养箱、三角瓶、带有过滤纱布（6层）的漏斗、血球计数板、1 000 μL移液枪、废液罐等。

1.2 主要试剂、溶液 新生牛血清：购自兰州荣晔生物科技有限责任公司。胰酶：Difco胰酶，购自美国碧迪医疗器械有限公司；Gibco胰酶，购自Life Technologies Corporation。染色液：1%中性红染液。抗菌素：每毫升10 000单位青霉素和庆大硫酸霉素。碱：5.6%碳酸氢钠溶液。营养液：0.5%乳汉液。洗涤液：汉克氏液。溶液均为自配，经过高压灭菌或者滤过除菌，经无菌检验合格后放入冷冻或2～8℃冰箱备用。

2 方 法

2.1 操作前准备 开启净化工作台，将需要预热的液体放置在37℃水浴锅中预热。

2.2 鸡胚的处理 取9～11日龄SPF鸡胚于超净工作台上，用碘酒棉对鸡胚气室部位进行消毒，然后用无菌镊子把气室部位的蛋壳敲破，沿气室部位夹去蛋壳，用眼科镊挑破壳膜和囊膜，夹出鸡胚放在平皿里[3]；用眼科镊剔除鸡胚的眼睛、脑部，用汉克氏液清洗2次，把清洗后的鸡胚移入搪瓷罐内，用眼科剪将鸡胚剪成米粒大小 （1～2 mm3）[3]， 把鸡胚等量移入2个100 mL锥形瓶中，并标号瓶1和瓶2，分别加入汉克氏液，混匀，静置使组织块下沉，弃去上清液，如此反复2次。

2.3 胰蛋白酶消化 将预热好的Difco胰酶溶液和Gibco胰酶溶液分别加入装有组织块的锥形瓶1和瓶2中，其中瓶1中加入的是由Difco厂家生产的胰酶，瓶2中加入由Gibco厂家生产的胰酶，并把2个三角瓶同时放入37℃水浴锅中，每隔10 min轻轻摇匀1次，使细胞消化均匀。消化30 min后，待组织块出现散松、绒毛状时取出锥形瓶1和瓶2，弃去胰酶溶液，迅速加入含有血清的乳汉液，静置数秒，弃去上清液。

2.4 细胞制备 将含有血清的乳汉液加入消化好的锥形瓶1和瓶2，并用高压过的无菌吸管多次吹吸，静置数分钟，使组织块下沉，用吸管吸出细胞悬液于2个100 mL干净玻璃瓶内，重复此操作，直至组织块发白、液体清亮为止。并用6层纱布过滤细胞悬液，除去杂质。

2.5 细胞计数 取1 mL细胞悬液，4 mL营养液并加入数滴1%台盼兰，充分混合，室温下静置5 min。用移液枪取少许细胞悬液滴在细胞计数板上，在倒置显微镜下观察，按白细胞计数法计算出每毫升中细胞数[4]。

2.6 细胞培养观察 将计数好的的细胞悬液1和细胞悬液2，等量分装于4个T25方瓶中，并做好标记（1-1、1-2、2-1、2-2），放入 CO2培养箱中 37 ℃培养。每天应定时观察，留意细胞生长情况，如有无污染、形态大小、生长状态等，并做好记录。

3 结果与分析

3.1 消化过程对比 在消化过程中，用Difco厂家生产的胰酶瓶1的胚体，在消化至28 min后有明显膨大疏松，边缘绒毛出现；Gibco厂家生产的胰酶瓶2在消化32 min后，胚体才出现类似情况。

3.2 细胞计数对比 同一时间内，2种胰酶溶液消化制备的细胞计数情况见表1。从表中可知：在相同的消化时间下，2种胰酶消化鸡胚制备的悬液细胞数，Difco厂家生产的胰酶略高于Gibco厂家生产的胰酶。

表1 细胞计数比对

3.3 培养过程观察 在CO2培养箱中37℃培养24 h后，通过倒置显微镜观察细胞生长情况及状态。2组细胞贴壁情况良好，生长状态旺盛，细胞在培养24 h后都明显形成致密单层；细胞生长情况良好，细胞透明，细胞质突起，细胞中央有卵圆形核，整个形态呈长梭形，细胞已呈纤维样形态。但细胞在贴壁过程中，使用Gibco胰酶消化液制备的鸡胚成纤维细胞已形成致密的单层，很难从形态上辨别纤维样形态（见图1A）；使用Difco胰酶消化液制备的细胞能辨别出明显的纤维状，呈单个个体较多 （见图1B）。

图1 2种胰酶消化液制备的鸡胚成纤维细胞培养24 h生长状态

4 讨 论

鸡胚成纤维细胞，因具有操作简便、适应能力强、增殖快、耐受性良好等特点，被广泛应用于生物制品领域的研究与生产。试验中选用的2种不同厂家生产的胰酶，首先是在各实验室和生物制品公司应用比较广泛，其次是想对比一下不同厂家生产的胰酶存在的差异性。

从整个试验过程以及细胞计数结果来看，在相同条件下，2种胰酶对组织块的消化作用不尽相同。在同等温度、消化时间时，Difco厂家生产的胰酶对鸡胚的消化作用强于Gibco厂家生产的胰酶。

在细胞的制备过程中，反复吹吸后静置时，用Difco厂家生产的胰酶消化的鸡胚，比较缓慢呈悬浮的状态在细胞悬液中，且在最后洗吸中，胚体也易被洗吹成“粉末”，因此，在细胞吹吸过程中，应控制吹吸的力度和次数。