猪流行性腹泻IgA、IgG抗体与PEDV抗原相关性研究

朱海侠 王玉玲 潘海城 曾亮明 傅星源 潘小慧李枭辰 俞建萍 范 凯 黄泽敏 翁燕梅 饶云萍

（福州大北农生物技术有限公司 福州 350014）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性、高度接触性消化道疾病。主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水等症状，腹泻仔猪死亡率高达100%[1]。PEDV是一种肠嗜性病毒，主要经消化道进入小肠感染机体。一旦被PEDV感染，PEDV在感染机体的肠绒毛上皮细胞内大量增殖，被感染的细胞迅速溶解坏死，导致明显的小肠绒毛萎缩，吸收表面积减少，小肠黏膜碱性磷酸酶含量显著减少，进而引起营养物质吸收障碍，导致腹泻、脱水、死亡[2]。研究发现PEDV的感染与仔猪日龄紧密相关，低日龄仔猪的感染和发病情况更为严重，14日龄以下仔猪感染PEDV后，其死亡率为90%，而14～28日龄仔猪的死亡率会下降至40%，提高低日龄仔猪对PEDV的抵抗力是保护仔猪的关键[3-4]。疫苗免疫母猪后，诱导乳汁免疫，随后通过其初乳和乳汁传递至新生仔猪，以实现对新生仔猪的早期被动免疫。低日龄仔猪肠道细胞再生较慢，或者初生仔猪各免疫系统还不够完善可能是导致哺乳仔猪发病率更为严重的原因[5]。而具备相对完善免疫系统的成年猪和育肥猪，病毒感染增殖的同时，肠内的多种免疫细胞针对各自特定靶细胞受体作出应激反应，阻止了猪流行性腹泻病毒继续感染机体。肠道组织中的局部黏膜免疫系统在对抗PEDV感染的过程中发挥了重要作用[6-7]。

尽管IgG抗体占初乳免疫球蛋白总量的60%以上，但IgA抗体对于中和肠道感染的病原体比IgG抗体更有效果[8]。母源抗体中的IgG免疫球蛋白被仔猪肠道吸收进入血液循环提供体液免疫，而IgA免疫球蛋白则粘附在肠道上。哺乳仔猪通过吮吸母乳获得母源抗体SIgA后，SIgA能够抑制PEDV在肠道上皮细胞的附着与增殖，保护仔猪肠道上皮细胞，阻止PEDV侵入机体[9]。研究表明，接受母源抗体的仔猪、保育猪粪样中PEDV的RNA载量明显减少，母猪乳汁IgA抗体水平高，其所产仔猪粪样中PEDV的RNA载量相对就低[10]。孔园园等[11]研究发现，母猪乳汁中IgA抗体水平高，仔猪发病率就会降低，反之发病率会增加。

本研究采用实验室已经建立的PEDV IgA、IgG抗体间接ELISA方法以及PEDV RT-PCR病原学检测方法，对免疫母猪群和疑似发生仔猪腹泻母猪群乳汁进行相关抗体水平及PEDV测定，探讨IgA、IgG抗体水平与PEDV病原之间的相关性，以期为我国猪群猪流行性腹泻免疫效果评估及程序的制定、优化提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品 乳汁采自广东地区某猪场疑似仔猪腹泻母猪群乳汁及免疫过猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗相关产品的猪群乳汁、血清。

1.2 主要试剂 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit购自金瑞鸿捷（厦门）生物科技有限公司；AMV反转录酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker 和dNTPs（2.5 mmol/L）购自宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技 （北京）有限公司；PEDV乳汁IgA、IgG抗体检测试剂盒为实验室自建。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 参照GenBank中登陆的PEDV ORF3基因序列，通过Primer Permier 5.0和Oligo 7.0软件在其保守区设计引物，引物序列及样品处理方法参照文献[12]。

1.3.2 PEDV RT-PCR的扩增 以处理好的样品cDNA为模板，用所设计的能够区分PEDV疫苗毒株与野毒株的特异性引物对疑似仔猪腹泻母猪群14份乳汁进行常规的PEDV RT-PCR检测，确定乳汁中PEDV的感染情况。扩增体系20 uL：其中2×Max 10 μL、上下游引物（20 μmol/mL）各 0.4 μL、cDNA 0.4 μL、 补充去离子水至终体积为 20 μL。PCR反应条件：98℃预变性 2 min，98℃变性 10 s；58℃退火5 s，72℃延伸5 s，30个循环。反应结束后，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 PEDV IgA、IgG抗体ELISA检测方法的建立采用纯化的PEDV抗原包被ELISA微量反应板，按照常规间接ELISA操作方法[13-14]，建立PEDV IgA、IgG抗体ELISA检测方法。采用PEDV抗体ELISA检测方法对上述送检的疑似仔猪腹泻猪场14份乳汁进行IgA抗体水平测定，并对免疫猪群乳汁对应的血清样品进行IgA、IgG抗体水平测定，确定乳汁中PEDV IgA抗体与血清中IgA、IgG抗体水平及其相关性。

2 结果与分析

2.1 PEDV RT-PCR扩增 采用特异性检测引物对疑似仔猪腹泻猪群的14份乳汁进行常规PEDV RT-PCR检测，确定14份乳汁中有6份为PEDV阳性 （确定7号样品为PEDV疫苗株，其片段大小为278 bp，其余5份均为PEDV野毒感染，其片段大小为327 bp），且腹泻猪只中PEDV野毒阳性率为100%（见表 1、图 1）。

表1 样品中PEDV抗原检测结果

2.2 乳汁IgA抗体水平的测定 采用实验室已经建立的PEDV IgA抗体检测方法对送检的14份乳汁样品进行IgA抗体水平检测。结果发现，14份乳汁中有4份IgA抗体呈现阴性，其中标记为腹泻猪只的IgA抗体阴性率占100%。且在阳性样品中，当乳汁中IgA抗体水平接近临界值（0.3）时，乳汁中PEDV基本呈现阳性（见表2）。

图1 乳汁样品中PEDV RT-PCR检测结果

表2 乳汁IgA抗体水平测定

2.3 PEDV IgA、IgG抗体水平的测定 采用实验室自建的PEDV IgA、IgG抗体检测方法对送检免疫健康猪群乳汁及其相对应的血清样品进行IgA、IgG抗体水平检测，结果发现，免疫猪乳汁中IgA抗体水平与血清中IgA、IgG水平呈现很好的正相关（见图2-图4），同时对乳汁和血清中IgA抗体水平进行测定，发现血清中IgA抗体远远低于乳汁中的抗体水平（见图 3）。

图2 乳汁中IgA、IgG抗体水平测定图

3 讨 论

研究表明，种猪胎盘屏障结构决定了母源抗体不能直接通过胎盘直接传递给仔猪，因此，仔猪获得母源抗体的主要途径是通过初乳的摄入。初乳中富含IgG抗体，仔猪摄入后迅速进入血液循环形成保护性抗体，摄入的IgA抗体可以在肠道局部黏膜建立黏膜免疫，共同抵御外界病原微生物的入侵[15]。对疑似发生仔猪腹泻母猪群乳汁进行PEDV病原学检测及IgA抗体检测发现，所有腹泻仔猪对应的母猪乳汁中PEDV抗原均呈现阳性，而腹泻仔猪所吮乳汁中IgA抗体呈阴性，且乳汁中IgA抗体水平趋于临界值的情况下，乳汁中PEDV亦呈现阳性。说明乳汁中IgA抗体水平可以反映出哺乳仔猪的黏膜免疫情况[16]。此外，乳汁中的IgA抗体只有达到一定的水平才能对仔猪肠道黏膜具有保护作用，低水平的IgA抗体很容易受到PEDV的攻击。通过检测乳汁中IgA抗体水平的高低，可以直接对疫苗免疫效力进行评价，进而分析仔猪的免疫保护力情况，及时做好PED的免疫防控工作。

图3 血清与乳汁中IgA抗体水平测定图

图4 血清中IgA、IgG抗体水平测定图

对免疫猪群乳汁IgA抗体及其对应的血清IgA、IgG抗体进行相关检测，结果发现：免疫猪乳汁中IgA抗体水平与血清中IgA和IgG水平呈现很好的正相关性，这与先前报道的结果一致[17]。研究表明，母猪口服感染PEDV的肠道内容物，利用荧光中和试验测定母猪和哺乳仔猪的血清、母猪初乳和乳汁中中和抗体滴度，结果发现在PEDV感染后3周内母猪血清样品中可检测到中和抗体，且乳汁中和抗体滴度至少与母猪血清样品中一样，而初乳样品中的抗体滴度均高于血清和血清样品。表明初乳和乳汁是仔猪中和抗体的来源[18]。对免疫猪群乳汁和血清中IgA、IgG抗体进行相关检测，结果提示，通过血清中IgG的抗体水平能够间接反映出母猪乳汁中IgA的抗体水平情况，解决了早期因乳汁黏度过大、难以采集的问题，大大提高了样品采集的效率，降低了猪只的应激反应，及时、有效地为我国猪群猪流行性腹泻免疫程序的制定及优化提供一定的参考依据。此外，乳汁中的IgA抗体水平远远高于血清中的IgA，再次佐证PEDV黏膜免疫机理：PEDV到达PP结后，致敏的B细胞可归巢至乳腺，在乳腺局部分泌二聚体IgA，以SIgA形式存在于乳汁中。单体IgA可以进入血液循环，SIgA难以进入血液，而是锚定在黏膜表面形成保护层，抵御病原侵入。

由猪流行性腹泻病毒引起的猪流行性腹泻在全国范围内暴发，且该病在临床中具有一定的隐蔽性，因此，探寻一个有效的免疫评估标准至关重要。为进一步探讨乳汁中IgA抗体水平与PEDV易感程度的相关性，本研究对健康场猪群乳汁IgA抗体水平及PEDV抗原进行检测，结果发现，乳汁IgA抗体阳性值接近临界值时，PEDV抗原检测为阴性，而在发病场猪群乳汁中则可以检测到PEDV抗原。该结果进一步验证了在存在PEDV感染的条件下，高水平的IgA抗体能够有效地抵御PEDV入侵。母源SIgA的水平与仔猪对PEDV感染的抵抗力有关，而血液中的中和抗体与其对仔猪的保护作用没有相关性[19-20]。因此，如何有效地刺激动物机体产生特异性的高水平IgA抗体，是防控猪流行性腹泻的关键。

4 结论

乳汁IgA抗体是有效保护低日龄仔猪早期免于PEDV感染的关键性抗体，其抗体水平较低的情况下，极易受到PEDV入侵，该抗体水平变化与疫病的进程和机体的抗病毒能力具有一定的相关性。此外，通过血清中IgG抗体水平的检测能够间接反映出疫苗的免疫保护水平，有效解决了初乳难以采集的问题，能够及时有效地为我国猪群猪流行性腹泻免疫程序的制定及其优化提供一定的参考依据。