胰岛素传递体体外HPLC分析

龚菊梅， 刘修树， 范高福， 刘龙云， 汤 洁， 范雪梅， 王义明

(1.合肥职业技术学院，安徽 合肥 230038; 2.清华大学 化学系，北京 100084)

传递体作为一种新型透皮给药制剂[1]，是在非封闭式给药的方式下，在角质层水合梯度的驱动下，结合自身具备的高度变形作用，高效穿透比其自身小数倍的皮肤孔道，到达真皮，随后是更深的组织，再经由淋巴系统进入血液从而使一些难以透皮的大分子药物成功进入皮肤甚至进入体循环[2]。

本实验采用高效液相色谱法对胰岛素传递体体外测定分析方法进行研究，HPLC法在用于胰岛素体外分析方法的建立上具有优势明显，具有准确度高，稳定性好、灵敏度强、重复性好等特点[3-4]。在方法的选择上参考脂质体的分析方法和质量检查项目，设计合理的胰岛素传递体体外分析的方法学内容，主要包括色谱条件的选择、系统适应性和方法专属性条件的确定、精密度和准确度的判断[5]、回收率[6]与包封率[7]方法的选择和考察等，通过高效液相色谱仪建立合理的胰岛素传递体体外分析的方法。同时验证了此方法学的可行性和准确性，从而为胰岛素传递体的处方设计、理化性质、体内分析和质量控制等后续研究提供坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

L-2000高效液相色谱仪(日本日立公司)；XS-105电子天平(梅特勒-托利多公司)；Labway Science Micro 22R型高速冷冻离心机(北京博威兴业科技发展有限公司)；TYP-2型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司)；PHS-3C pH计(北京博远祥德科学仪器有限公司)。胰岛素对照品(sigma公司，批号：20121023)；胰岛素原料药(sigma公司，批号：20130510)；猪胆酸钠(北京奥博星生物技术有限责任公司)；葡聚糖凝胶G-50(分析纯，北京索莱宝科技有限公司)；三乙醇胺(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；乙腈(色谱纯，色谱纯，德国merck公司)；乙醇(分析纯，北京化学试剂公司)；磷酸二氢钠(分析纯，北京化工厂)；卡波姆(Noveon公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱选用Phenomenex Luna C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm),流动相:A 0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)，B 乙腈；梯度洗脱如下: 0～6 min,26%～32% B;6～10 min,32% B;10～16 min,32%～38% B;16～22 min,38% B 流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：214 nm。

1.2.2 标准储备液制备 精密称取胰岛素4.00 mg，加0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)定容于10 mL容量瓶中，配制成400 μg/mL的对照品储备液，置4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 对照品溶液的配制 精密量取胰岛素对照品储备液1 mL至5 mL容量瓶中，加0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)溶解并定容，得到浓度为80 μg/mL的胰岛素对照品溶液。

1.2.4 供试品溶液配制 吸取胰岛素传递体适量，置于10 mL容量瓶中，加入一定量乙醇破乳，用0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)稀释至刻度，摇匀，制得供试品溶液。精密量取空白传递体0.5 mL，按上述方法破乳定容后，即得空白供试品溶液。

1.2.5 方法专属性考察 分别取胰岛素对照品溶液、空白传递体溶液和胰岛素传递体供试品溶液各20 μL注入高效液相色谱仪，比较3组色谱图，考察所用辅料对胰岛素的含量测定是否有干扰，并记录色谱图。

1.2.6 线性关系考察 分别精密量取“2.2”节下对照品储备液溶液(400 μg/mL)，用0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)配制成400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的对照品溶液，分别过0.45 μm滤膜，进样，记录峰面积，并以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标得到标准曲线。

1.2.7 系统适应性试验 取“线性关系考察”节下的对照品溶液，重复进样5次，记录峰面积和保留时间，计算RSD值。

1.2.8 精密度实验 精密量取对照品储备液适量，用磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)配制200、100、50 μg/mL的高、中、低3 个质量浓度的溶液，各3 份，参照“2.1”节下的色谱条件在1 d内进样3次，每次20 μL，记录峰面积，计算日内精密度；每天测定1 次，连续3 d，记录峰面积，计算日间精密度。

1.2.9 回收率实验 分别精密量取400、500、600 μL对照品储备液(400 μg/mL)至2 mL容量瓶中，分别加500 μL的空白传递体，加入500 μL的乙醇破乳后，再用pH 3.0的磷酸盐缓冲液定容至刻度，即得浓度分别为80、100、120 μg/mL含空白传递体的胰岛素溶液。按“2.1”节下的色谱条件连续进样20 μL，平行3次，记录峰面积，计算回收率。

1.2.10 包封率及载药量的测定 取3份胰岛素传递体样品，每份各1 mL分别置于1.5 mL的离心管中，于4 ℃，20 000 rpm，30 min条件下离心，取上清液约400 μL，定容至1 mL，经HPLC分析，计算传递体中未被包封的胰岛素质量M1；另取胰岛素传递体溶液400 μL，加入适量乙醇破乳后定容至1 mL，进样分析，计算体系中总胰岛素的含量M0，计算3 份样品中胰岛素传递体包封率(EE)[9-10]，计算RSD值。

2 结果与分析

2.1 方法专属性考察

通过对胰岛素对照品溶液、空白传递体溶液和胰岛素传递体供试品溶液的考察，所得色谱图如图1所示。

注：A空白传递体、B胰岛素标准品、C胰岛素传递体

由图1可知,胰岛素对照品溶液、空白传递体溶液和胰岛素传递体供试品溶液的色谱图中，胰岛素的保留时间均在8.0～9.0 min，主药峰与辅料峰良好分离，辅料对胰岛素测定无干扰，表明此方法专属性好。因此，此色谱条件可用于胰岛素传递体中主药含量的测定。

2.2 线性关系考察

胰岛素溶液标准曲线见表1，标准曲线见图2，线性回归方程为Y=36 595X-288 707，R2=0.999 6，胰岛素在6.25～400 μg/mL的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表1 胰岛素溶液标准曲线测定结果

图2 胰岛素标准曲线

2.3 系统适应性试验

通过胰岛素对照品5次重复进样后记录的峰面积和保留时间的数值，计算得到的胰岛素峰面积和保留时间的RSD值为1.02%、0.75%，均符合要求，说明该方法下的仪器系统适应性良好。

2.4 精密度实验

日内和日间精密度结果见表2，结果表明该方法精密度符合方法学要求，可用于含量测定。

表2 胰岛素传递体日内、日间精密度测定(n=3)

2.5 回收率实验

回收率结果见表3，结果表明回收率在98%～105%之间，RSD值<2%，该方法回收率符合方法学要求，方法的准确性良好。

表3 胰岛素传递体加样回收率试验结果

2.6 包封率及载药量的测定

测定3批胰岛素传递体供试品的包封率，3次实验计算结果显示，制得的传递体对胰岛素的包封率3次测定结果分别为83.65%、83.53%、83.89%。均值为83.68%，RSD值0.18%。均满足药典对脂质体包封率的要求(>80%)。

3 结论与讨论

传递体作为一种特殊的脂质体，具有高度的变形力。以传递体作为载体，介导胰岛素可制备成经皮给药制剂，通过透皮吸收解决胰岛素不能口服，只能注射的缺点，为胰岛素新制剂的研究提供一种思路。

本文采用了HPLC法建立胰岛素传递体体外分析的方法，HPLC法准确性高[8]，灵敏度强，重现性好，符合样品分析要求[9]。系统适应性和方法专属性考察中，辅料对主药无干扰且方法准确性高[10]；精密度和回收率均符合要求；同时确立了胰岛素传递体包封率测定的方法：低温高速离心法。此方法操作简单，结果准确[11]，测定的胰岛素传递体包封率符合《中国药典》要求。

包封率测定方法选择的关键是游离药物与传递体制剂的分离效果。本实验中，以包封率为考察指标，对葡聚糖凝胶法、超滤离心法和低温高速离心法3种常见的包封率测定方法进行比较，结果表明，胰岛素传递体和未包封的游离胰岛素在4 ℃，20 000 rpm，30 min的条件下能够很好分离，通过测定游离胰岛素的含量计算出的胰岛素传递体的包封率，符合药典对包封率的规定，最终确定低温高速离心法作为胰岛素传递体包封率测定的方法。