体外法估测日粮和饲料原料外源代谢葡萄糖值

■李 强 吕良康 熊 奕 张 慧 方 勇 冯 志 任 莹 赵胜军，2*

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023；2.湖北省饲料工程技术研究中心，湖北武汉430023）

葡萄糖是唯一一种能通过血浆和细胞在全身循环的单糖，是生命活动所需能量的重要来源[1]。葡萄糖的吸收和利用在动物能量代谢中居于中心地位，如参与神经调节、机体活动等的各种代谢[2-3]。动物机体内葡萄糖主要包括两种来源：外源葡萄糖和内源葡萄糖。外源葡萄糖指的是饲料内的可溶性糖和淀粉在消化道前段经过消化酶作用形成葡萄糖并由消化道吸收的部分[4]。而内源葡萄糖为肠前段未被消化吸收的营养物质由肠道微生物发酵分解，生成挥发性脂肪酸，通过肠壁扩散进入体内，由非糖物质（如乳酸、乙酸、丙酸等）在肝脏经糖异生作用转化为葡萄糖的部分[5]。

根据前期研究基础，方勇通过在猪回肠末端手术安装“T”型瘘管，测定出日粮外源MG的含量[6]。了解到日粮中所含外源葡萄糖含量测定的关键在于确定淀粉在小肠内的消化率[7]。但运用体外法测定外源葡萄糖就无需复杂的手术或屠宰取样，更具便捷性。同时还能完善体内法难以测定某单一饲料原料消化率的缺陷，可用于饲料营养价值的评定。

本研究通过与体内法测得的4种仔猪常用日粮的MG值相关性分析，拟确定最为合适条件的体外模拟消化法，随之运用方法测定几种常用仔猪饲料外源MG的含量，为建立以仔猪MG为营养基础的饲料评定新体系和葡萄糖营养调控技术的可行实用化奠定基础。

1 材料方法

1.1 试验设计

对于体外酶促消化反应，温度、pH值和消化时间之间几乎无交互关系[8]，且Wilfart 等[9]研究显示，猪采食后食糜平均1 h 到达十二指肠近端，从十二指肠近端到回肠远端平均时间为4 h。因此为探寻最佳体外模拟消化条件，设计消化时间为单因素处理，分为1、2、4、6 h和8 h共5个处理，通过“胃蛋白酶-胰蛋白酶两段法”对四种日粮进行体外模拟消化。并逐一将各个处理组的降解率与通过体内法测得的日粮淀粉消化率进行相关性分析对照，以两者相关性最好的处理组时间作为体外法测定外源MG的最优时间。

根据已确定的最优体外模拟消化时间和其它试验条件，测定六种常见饲料原料的MG值。

1.2 试验日粮

六种常用饲料原料：玉米（新疆）、玉米（吉林）、二等小麦（荆门）、麦麸（周口）、豆粕（46%，江苏）、豆粕（43%，武汉）。

4 种试验日粮参照NRC（2012）饲养标准配制，同时按照千分之一比例添加TiO2作为外源指示剂，其中日粮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ淀粉水平分别为25.81%、31.73%、45.71%、49.06%。其具体组成及营养水平见表1。

1.3 主要试剂、器材

胃蛋白酶（阿拉丁，P110928），胰蛋白酶（阿拉丁，P110505），100 ml三角瓶，恒温摇床（上海知楚仪器有限公司，ZHSY-50）。

1.4 操作方法

1.4.1 消化液的配制

①拟胃液溶液：量取8.3 ml 浓盐酸，同时称取3.159 g NaCl 置1 000 ml 容量瓶中，加适量蒸馏水溶解稀释置刻度，摇匀备用。

②2 mol/l NaOH溶液：称取氢氧化钠固体80 g，加适量蒸馏水稀释，并转移至1 000 ml容量瓶，定容备用。

③0.1 mol/l磷酸缓冲液：量取0.2 mol/l 磷酸二氢钾溶液250 ml 至1 000 ml 容量瓶，后添加0.2 mol/l NaOH 溶液118 ml，加适量蒸馏水稀释定容（含0.05%迭氮钠）。

表1 日粮组成和营养水平

1.4.2 体外消化方法

本研究在已建立的体外消化试验[8，10-15]基础上，根据试验目的和试验条件做出适当调整，具体方法如下：

①模拟胃消化阶段

粉碎已烘干饲料样至过100目筛，称取5 g（精确至0.000 1 g）于三角瓶中，分别加入胃蛋白酶500 mg，拟胃液溶液50 ml，以及0.5%氯霉素溶液[10]（细菌生长抑制剂）0.5 ml，后于恒温摇床上消化1 h（40 ℃，120 r/min）。

②模拟小肠消化阶段

模拟胃消化1 h 后，向三角瓶中继续加入2 mol/l氢氧化钠溶液2.5 ml，调节pH 值至中性，再加入磷酸缓冲液20 ml 和50 mg 胰蛋白酶，后于恒温摇床中消化1、2、4、6 h和8 h（40 ℃，120 r/min）。

③消化残渣的收集

待模拟小肠消化阶段结束后，取出三角瓶，并用冰水多次冲洗瓶外壁，以使酶活反应降至最低甚至完全抑制。取得消化后的滤渣，用已知质量的纱布包裹滤渣放入烘箱（105 ℃，8 h），后称重记录。

1.5 测定指标和方法

根据雷龙等[16]（2017）的酶解法，来测定体外模拟消化所得残渣的淀粉含量。

1.6 体外法淀粉降解率计算公式

P（%）=[(m1-m2)/m1]×100

式中：P——淀粉的体外降解率(%)；

m1——样品中淀粉量(g)；

m2——消化后残渣中淀粉量(g)。

1.7 数据分析

数据采用Excel 2016进行初步整理，用SPSS 23.0统计软件进行统计分析，采用“平均数±标准差”表示，单因素方差分析进行显著性检验，采用Duncan's多重比较。

2 结果与分析

2.1 消化时间对日粮淀粉体外降解率的影响

表2 体外消化时间对日粮淀粉降解率的影响(%)

四种日粮淀粉体外降解率见表2，图1。可以看出，在消化时间1 h 到6 h，四种日粮淀粉降解率都随时间延长而呈显著提高（P＜0.05），但在消化6 h 后涨幅变慢，表现为6 h 与8 h 的淀粉降解率无显著差异（P＞0.05）。

图1 体外消化时间对日粮淀粉降解率的影响

2.2 体外淀粉降解与体内淀粉消化的相关性分析

根据方勇的体内法测得的淀粉消化率值，都高于本研究测得的日粮淀粉降解率[6]，将体外法各处理组值分别与其进行相关性分析对照，相关系数都大于0.900 0，其中体外消化6 h 的相关系数较高。如图2所示，体外消化6 h的测定结果为自变量，以体内法测定结果为因变量，回归方程为y=0.137 4x+84.834（R2=0.871 1），r=0.933 3。因此进行体外模拟消化测定淀粉消化率的最优时间确定为6 h。

2.3 六种常用饲料原料的淀粉体外降解率及外源MG值

将回归方程（y=0.137 4x+84.834）与外源MG 的公式整合，即可得到体外法测定日粮外源MG的估算公式：

外源MG值（g/kg）=小肠淀粉量×（0.14×体外法测的小肠淀粉消化率+84.83）/0.9

式中：0.9为葡萄糖和淀粉的转换系数。

运用上述方法和公式，评定了六种常用饲料原料，其结果如表3。

图2 体外消化6 h测定淀粉降解率与体内法淀粉消化率的回归关系

表3 六种常用饲料原料淀粉体外降解率及外源MG值

3 讨论

外源MG 主要是指淀粉在肠道前段经一系列的作用后被小肠所吸收的葡萄糖，所以小肠的淀粉消化率是影响外源MG 的主要因素。体内法测定小肠淀粉消化率需要分别测定日粮和食糜中的脂肪含量[7，17-18]，则需进行动物屠宰试验或者通过手术安装“T”型瘘管，试验过程复杂且不能够测定某单一饲料原料的消化率。

在“胃蛋白酶-胰蛋白酶两段法”的体外模拟消化法中，消化的时间长短可影响消化的速率以及消化程度。本研究中，在消化时间1 h 到6 h，四种日粮淀粉降解率都随时间延长而呈显著提高的趋势（P＜0.05），6 h后的降解速率减缓，消化6 h与8 h的淀粉降解率无显著差异（P＞0.05）。体外法测定的日粮淀粉降解率与体内模拟消化法测得的淀粉消化率相比较低，对两者进行相关性检验分析，在体外模拟消化6 h 时与体内消化有较高的线性相关系数（r=0.933 3）。本试验与现有的研究结果相同[19-21]。因此，体外模拟消化试验的最佳时长为6 h。

“胃蛋白酶-胰蛋白酶两段法”采用模拟动物消化道内的两步酶解对淀粉进行消化的一种体外法，收集模拟消化后的剩余残渣，测定淀粉含量，推算小肠淀粉消化率，本试验方法具有高效、快捷、可重复等特点，甚至可以测定单一原料的消化率[6，22]。体外测定结果与体内试验测定结果有相关性，对配方的制作有很大的参考价值。在体外消化6 h时与体内法相关性分析结果得到，两者相关系数r=0.933 3，这与张铁鹰等（2005）的报道一致[23]。建立本试验方法后，本试验测算了6种常用原料淀粉的体外降解率及其外源MG值，为今后各种原料MG 数据库的建立奠定基础，为实现猪日粮MG评价体系的建立提供可能。

4 小结

①体外模拟消化法测定淀粉消化率的最佳消化时长为6 h；

②体内法测得的淀粉消化率与体外模拟消化6 h 的淀粉降解率的线性回归方程为：y=0.137 4x+84.834（R2=0.871 1）。由此推算出饲料外源MG 的体外法估算公式为：外源MG=（0.14×体外法测的小肠淀粉消化率+84.83）/0.9×小肠淀粉量;

③6 种猪料原料的外源MG 的含量为：玉米（吉林）667.41 g/kg、玉米（新疆）741.10 g/kg、麦麸（周口）396.40 g/kg、二等小麦（荆门）632.22 g/kg、豆粕（43%，武汉）84.11 g/kg、豆粕（46%，江苏）93.25 g/kg。