血清 Bax、Caspase-3、MDA、8-OHdG 水平与癫痫发作及认知损害的关系

李磊

(新乡市中心医院神经内科，河南 新乡 453000)

流行病学研究显示，癫痫的发病率可达333～566/10万人左右[1]。在合并有精神病相关家族史的人群中，癫痫的发病率可进一步上升。不同的因素或者生物学因子的改变，均可以影响癫痫的发生，导致患者认知、行为及精神活动功能的异常。其中Bax、Caspase-3作为凋亡相关因子，能够通过促进神经元细胞的凋亡，影响到局部氧化应激反应的发生，从而影响到神经元的生物电活动[2，3]；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、8-羟基脱氧尿苷酸 （8-hydroxy deoxy uridine，8-OHdG）的异常表达，能够通过诱导下游趋化因子的富集，导致炎症的浸润，促进神经纤维鞘膜完整性的破坏，增加大脑皮层及海马等区域同步电活动的发生风险[4]。部分研究揭示了MDA在癫痫患者血清中的异常表达情况，认为MDA的表达上升是影响到癫痫患者中枢神经系统功能恶化的重要风险，但对于Bax、Caspase-3、8-OHdG等的分析研究不足。为了进一步探讨血清 Bax、Caspase-3、MDA、8-OHdG 与癫痫发作、病情及认知损害的关系，从而为临床上癫痫患者的临床预后评估提供参考，本次研究选取我院收治的确诊的癫痫患者90例，探讨了相关指标的异常表达及其与患者认知等功能的关系。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取2015年1月至2017年6月新乡市中心医院收治的确诊的癫痫患者90例（病例组）、同期健康体检对象60例（对照组）。病例组，男 49 例、女 41 例，年龄 29～77 岁，平均 48．4±15．6岁，其中癫痫发作患者62例（全身性强直-阵挛性发作27例、复杂部分性发作11例、部分性发作继发全身性强直-阵挛性发作10例、单纯部分性发作14例），癫痫发作严重程度NHS3评分[1]14．3±3．9 分；癫痫非发作患者 28 例。 对照组，男 35例、女 25 例，年龄 32～75 岁，平均 45．8±11．4 岁。 两组研究对象的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0．05）。

1．2 纳入排除标准

1．2．1 纳入标准 ⑴癫痫患者的诊断标准参考中华医学会精神病学分会制定的诊断标准；⑵患者年龄范围18～79岁；⑶患者具有明确的癫痫病史及病因；⑷本研究获得患者家属的知情同意。

1．2．2 排除标准 ⑴酗酒患者；⑵合并恶性肿瘤疾病；⑶长期使用卡马西平、丙戊酸钠的患者；⑷既往伴有精神、认知功能疾病；⑸合并颅脑创伤、代谢异常、寄生虫病等。

1．3 检测方法 MDA、8-OHdG水平的检测：清晨采集空腹静脉血，按照2000r/min离心5min分离血清，-20℃保存待测，采集标本后1周内检测MDA、8-OHdG，采用瑞士罗氏全自动生化分析仪E170模块进行检测，检测试剂盒购自上海泰康生物科技有限公司。

Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的检测：每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0．2ml的氯仿，加 0．2ml氯仿，剧烈摇动 30s， 室温 3min，3000r/min，4℃离心15min得到RNA。加等体积异丙醇，-20℃，30min，弃上清，加 75%乙醇 1ml，振荡，20μl DEPC水，室温放置5min使其完全溶解。加入逆转录酶5ul，室温下放置20min后植入37℃水浴锅中孵育30min，在底物中加入上游引物0．5uM、下游引物 0．5uM，RT-PCR 反应混合液 5ul，dNTP 稀释至 20ul，反应条件：95℃ 3min、95℃ 15s、90℃ 5s，一共40个循环，产物扩增长度为134bp。

1．4 认知功能评价 采用蒙特利尔认知功能评估量表（MoCA）[2]对患者的认知功能进行评价，包括了注意与集中、执行功能、记忆、语言、视结构技能、抽象思维、计算和定向力等8个认知领域的11个检查项目。总分30分，≥26分正常。

1．5 统计学方法 统计软件采用SPSS 16．0版本，满足正态分布的计量资料采用（x±s）描述，两组数据比较分析采用t检验，数据相关性分析采用Pearson线性相关分析法；P值＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 研究组和 对照组 的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平、MoCA评分比较 研究组患者的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平、MoCA评分均显著的高于对照组（P＜0．05）；见表 1。

2．2 发作组和非发作组的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平比较 发作组患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG 水平、MoCA 评分均显著的高于非发作组 （P＜0．05）；见表2。

2．3 发作的癫 痫患者 的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平与发作严重程度关系癫痫发作组患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平与NHS3评分均呈显著的正相关关系（P＜0．05）；见表 3。

2．4 癫 痫 患 者 的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平与患者认知损害的关系 90例癫痫患者的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平与MoCA评分均呈显著的负相关关系（P＜0．05）；见表 4。

3 讨论

遗传易感因素、自身免疫功能的紊乱及病毒感染等，均可以促进中枢神经细胞神经元细胞的异常放电，导致癫痫的发生，特别是在年龄大于35岁具有中枢神经系统病变的患者中，癫痫的发病率更高，可较普通对照人群上升 3～4倍[1，5]。 临床上癫痫的发生严重影响到了患者的生活质量和生命安全。一项汇集了119例样本量的临床回顾性分析研究显示，迄今为止临床上癫痫的总体治疗有效率不足45%，且停药后复发率较高[6]。而通过对于癫痫发病过程中相关因子的表达分析研究，可以为癫痫的生物靶向治疗或者免疫治疗提供新的靶点或者思路。

表 1 两组 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG 水平、MoCA评分比较

表 1 两组 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG 水平、MoCA评分比较

Bax mRNA（相对表达） Caspase-3 mRNA（相对表达） MDA（μmol/L） 8-OHdG（pg/ml） MoCA评分（分）0．78±0．21 0．28±0．10 17．176 0．000 0．76±0．28 0．25±0．10 13．532 0．000 8．46±2．28 5．63±1．59 8．351 0．000 442．6±59．1 316．7±32．8 15．02 0．000 25．1±2．2 26．8±1．7 8．255 0．000组别 n研究组对照组t值P值90 60

表2 发作与未发作患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平比较

表2 发作与未发作患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平比较

Bax mRNA（相对表达） Caspase-3 mRNA（相对表达） MDA（μmol/L） 8-OHdG（pg/ml）0．97±0．16 0．55±0．18 11．085 0．000 0．92±0．20 0．61±0．24 6．390 0．000 9．21±1．98 7．30±2．14 4．131 0．000 465．5±48．4 392．4±50．0 6．566 0．000发作情况 n发作组非发作组t值P值62 28

表3 发作患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG与NHS3评分的关系

表4 癫痫患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG与认知功能损害的关系

MDA、8-OHdG在恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的发生过程发挥了重要的调控作用，同时在中枢神经系统疾病等的发生发展过程中同样具有潜在作用[7]。MDA、8-OHdG可以通过影响到下游基因或者蛋白的翻译和表达，进而导致细胞内信号通路的激活。MDA、8-OHdG可以通过影响到神经元鞘膜的完整性，促进神经元细胞损伤和异常放电，促进了癫痫病情的进展[8，9]，特别是相关指标对于神经鞘膜组织的核糖核苷酸及还原型谷胱甘肽等代谢的影响，能够诱导氧化应激反应的发生，促进下游趋化因子如C3、C4的激活，增加中枢神经系统的免疫性损伤[10]；Bax mRNA、Caspase-3 mRNA作为基因转录水平的改变，能够通过诱导下游凋亡效应蛋白的翻译，促进神经元细胞的凋亡，破坏神经元细胞的生物电传递的完整性，增加电活动的同步性[11]。同时Bax mRNA、Caspase-3 mRNA翻译增强诱导的海马区域及大脑皮层组织的多巴胺代谢障碍，能够增加癫痫大发作或者部分性发作的风险。

本次研究通过相关指标的血清学检查及基因检测分析可见，癫痫患者的血清中Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG等的表达强度明显上升，高于正常对照人群，提示不同的指标均可能参与到癫痫患者的生物电活动的异常，促进了癫痫的发生[12，13]： ⑴Bax mRNA、Caspase-3 mRNA对于下游BAX蛋白或者其他凋亡相关因子的激活，能够导致神经元的程序性凋亡和中枢神经系统电传导完整性的破坏；⑵MDA、8-OHdG对于谷胱甘肽芳基转移酶或者氨基转移酶的活性影响，能够促进神经元鞘膜组织的炎症性损伤，促进神经元细胞膜间的电传导频率的增强，提高局部神经元的异常同步放电的风险。Aanandhi M等[14]学者在探讨了73例样本量的小发作型癫痫患者的血清学资料，发现Caspase-3的阳性表达率可平均上升25%以上，同时患者的认知功能越差、行为障碍或者合并有明显的神经系统并发症的人群中，Caspase-3的阳性表达水平可进一步上升。 发作组患者的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平的上升更为明显，提示急性发作期患者的体内相关生物学因子的波动较为显著，考虑可能与下游炎症因子IL-6或者肿瘤坏死因子α等的激活，通过接触性抑制神经元递质谷氨酰胺或者磷酸腺苷等的释放，促进神经元轴突末梢间神经递质的传递，增加了神经元同步放电的风险有关。在探讨癫痫患者相关神经系统功能改变的过程中发现，癫痫患者的认知或者中枢神经系统功能评分等与患者体内的凋亡相关基因或者MDA、8-OHdG水平等均密切相关，这考虑可能与凋亡基因的表达转录增强，影响到了突触后膜囊泡运输机制的异常，并干预到了神经元细胞内异常蛋白的沉积，增加了神经元细胞的病变及脑胶质成分的代偿性改变有关[15]。但部分研究者并未发现MDA等指标与患者的认知功能的关系，考虑可能与癫痫患者的病程、既往基础性的治疗差异等因素有关。

综上所述，癫痫患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平较正常人群显著的升高，并且与患者病情严重程度、认知损害具有显著的相关性。