甲基绿与吡罗红染色效果及染色机理的探析

福建 四川

现行高中生物教材（人教版、浙科版、北师大版、苏教版）中都介绍了利用甲基绿、吡罗红（又称派洛宁、焦宁）混合染液对细胞进行染色，从而观察DNA和RNA在细胞中的分布。教材中该染色实验比较强调甲基绿、吡罗红需要先混合再进行染色，但在高考试题中还多次考查了甲基绿单独染色的实验效果。为验证甲基绿和吡罗红单独染色、混合染色和分染的实验效果，笔者尝试以对高考试题分析着手，依据实际实验结果探讨两种染液的染色机理和部分高考试题。

1.高考原题再现

【例1】（2012年，江苏卷，第19题）表1中有关人体细胞化合物的各项内容，正确的是 （ ）

表1

A.① B.② C.③ D.④

【参考答案】C

【分析】例1的④被排除在正确选项之外，江苏省考试院给出本题④选项的解析为“核酸包括DNA和RNA，甲基绿染液仅是DNA的染色剂，故D选项错误”。可见该题命题者认为甲基绿染液仅是DNA（脱氧核糖核酸）的染色剂，不能与RNA（核糖核酸）作用呈现颜色。类似试题还有2009年江苏卷第21题D选项。

【例2】（2016年，海南卷，第15题节选）下列实验中，加入试剂后不能产生特定颜色的是 （ ）

B.黑暗中生长24 h的天竺葵叶片，用碘液检测淀粉

C.玉米根尖经甲基绿染色后，在显微镜下观察细胞核

【参考答案】B

【分析】本题的C选项考查甲基绿单独染色效果——在显微镜下可以观察到细胞核呈绿色。教育部考试中心给出的C选项的解析为“甲基绿溶于水，显蓝绿色，为碱性染料，甲基绿与DNA的亲和力很强，能使DNA呈现绿色，因此玉米根尖经甲基绿染色后，在显微镜下观察细胞核被染成绿色”。类似试题还有2014年重庆卷第1题A选项和2008年江苏卷第4题D选项。

2.甲基绿、吡罗红单独染色实验效果验证

以洋葱鳞片叶内表皮细胞为材料，利用0.15%甲基绿单独染色时染色效果如图1和图2所示，由图可知，甲基绿在单独染色时能将细胞核染成明显的蓝绿色（图中深色部分），同时细胞质部分也呈现淡绿色。本实验同样利用了2%吡罗红对洋葱鳞片叶内表皮细胞进行染色，染色效果如图3和图4所示，发现吡罗红在单独染色时能将洋葱鳞片叶内表皮细胞核染成较深的紫红色（图中深色部分），细胞质部分也呈现淡红色。该实验验证了甲基绿单独染色时细胞核和细胞质都显出绿色，吡罗红单独染色时细胞核和细胞质都显出红色。在显微镜下都可以清晰地观察到细胞核，例2等相关选项与实验结果相符。

图1 酸解后，0.15%甲基绿染色效果

图2 不酸解，0.15%甲基绿染色效果

图3 酸解后，2%吡罗红染色效果

图4 不酸解，2%吡罗红染色效果

3.甲基绿、吡罗红混合染色法与分染法实验效果验证

在“观察DNA和RNA在细胞中的分布”的教材实验中，通常采用甲基绿、吡罗红混合染色法进行实验。但因当前市场上没有甲基绿和吡罗红的混装粉出售，故采用的是以下方法配制两种染液：分别取甲基绿2g溶于98mL蒸馏水中制成2%的甲基绿溶液，取吡罗红5g溶于95mL蒸馏水中制成5%的吡罗红溶液，放入棕色瓶中备用。经多次实验发现，实验成功有几个关键影响因素：①染液的pH：pH偏高时吡罗红不易着色，pH偏低时甲基绿不易着色，pH为4.8时染色效果最好。故实验中可利用pH为4.8的缓冲液代替蒸馏水冲洗，保证染色时处于适宜的pH条件下。②甲基紫的影响：甲基绿久置易产生甲基紫，在染色过程中容易使细胞核偏紫色。因甲基紫溶于氯仿，故可利用氯仿抽提除去甲基紫，排除甲基紫对实验的干扰。③酸解的影响：盐酸浓度太高易引起洋葱鳞片叶内表皮细胞发生严重的质壁分离；解离过度还易使细胞核偏向蓝紫色，2%的盐酸解离2min再染色或不解离直接染色效果更好。④材料的新鲜程度：材料不新鲜，其DNA和RNA可能发生降解，导致细胞核染色后偏向紫色，而细胞质不着色。⑤染色的时长：甲基绿易进入细胞使细胞核染色，对细胞质的染色则很浅；吡罗红进入细胞的速率相对较慢，对细胞质染色较深，但也会与细胞核结合，染色时间过长易使细胞核偏向蓝紫色。⑥两种染料的配比：若吡罗红比例偏高，则细胞质呈红色，细胞核偏向紫色；若吡罗红比例偏低，则细胞质着色很浅，只有适当的浓度和配比才能在染色后使细胞核呈绿色，细胞质及核仁呈红色。但因购置的药剂纯度通常不同（甚至未标注纯度），使得不同文献给出的试剂配比有较大差别，如陈小辉的《洋葱内表皮细胞中DNA和RNA染色方法的改进》。此外，甲基绿和吡罗红在配制过程中都存在较多不溶解的杂质，需要过滤后再使用，使得所配制的溶液实际浓度更加难以确定，故教师在实验前需要先做预实验以确定合适配比。经多次实验发现，以0.15%的甲基绿和2%的吡罗红混合染色剂，染色1～2min，效果较好，酸解后染色，细胞核呈蓝色；如果不酸解直接染色，细胞核常呈绿色或蓝绿色，最接近教材效果（如图5和图6所示）。

图5 酸解后，0.15%的甲基绿，2%的吡罗红混合染色

图6 不酸解，0.15%的甲基绿，2%的吡罗红混合染色

图7 酸解后，先用0.15%的甲基绿染色，再用2%的吡罗红染色

图8 酸解后，先用0.15%的甲基绿染色，再混合染色

沈晓蜜在《对“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验的几点思考》中指出，本实验也可以采用分染法进行。实验发现，先用一种染料染色后，再用另一种染料覆盖染色，细胞质颜色先被置换，随后细胞核颜色变成两种染料的混合色。将材料酸解后，先用0.15%的甲基绿染色 3min，利用缓冲液洗去浮色，再用2%吡罗红染色30s左右，立即将吡罗红吸去，洗去浮色，效果也较好，并且可以观察到核仁被染成红色（如图7所示）；若材料不经酸解，吡罗红染色时间需延长至3～4min。调换染色顺序，细胞质先被置换成绿色，细胞核却仍是红色，随染色时间延长慢慢向蓝紫色变化，说明吡罗红与细胞核结合较紧密，较难被甲基绿置换。实验中，材料经酸解后，先用0.15%的甲基绿染色3min，再以0.15%的甲基绿和2%的吡罗红混合染色剂染色2min，效果也很好（如图8所示）。

混合染色或分染时，若细胞质呈明显紫色，细胞核常呈偏蓝色或蓝紫色，究其原因：甲基绿进入细胞较快，先结合细胞核使之呈绿色，但随着染色时间延长，吡罗红进入细胞后容易与甲基绿竞争结合DNA，而使细胞核逐渐从绿色变换成蓝色，进而呈蓝紫色或紫色。盐酸水解可以使染色剂更易进入细胞，使细胞染色均匀，而吡罗红也可快速进入细胞，与细胞核结合，使细胞核呈蓝色。

4.两种染液染色机理探析

人教版高中生物教材在“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验中给出甲基绿、吡罗红染色原理：“甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色。利用甲基绿、吡罗红混合染色剂将细胞染色，可以显示DNA和RNA在细胞中的分布。”教材中只是提到两种染色剂与DNA和RNA的亲和力不同，但师生却容易误认为甲基绿仅能与DNA结合使其呈现绿色，吡罗红仅能与RNA结合使其呈现红色。

从分子结构分析，DNA和RNA中含碱基和磷酸基团，碱基上一些含孤对电子的N或其他基团可以接受质子或释放质子，从而带正电或负电；核苷酸链末端的磷酸基团可以两步解离，释放两个质子，其余绝大多数的磷酸基团只存在一步解离，因释放出一个质子而带负电，故在水溶液中核酸可以看作是两性电解质。磷酸基团的酸性较碱基的碱性强，故核酸通常表现为酸性（带负电荷），容易与带正电荷的碱性染料以离子键或氢键的形式相结合。DNA的磷酸基团排列在双螺旋结构的外侧，更容易电离而带负电荷；RNA除了因磷酸基团容易电离带负电荷外，其碱基也常暴露在外，解离后而带正电或负电。由于DNA和RNA的碱基组成、结构以及分子大小不同，两者的等电点不同，在同一种pH溶液中的带电性也有所不同。

甲基绿和吡罗红的发色基团均为醌基，电离后带一个正电荷，故甲基绿、吡罗红都为碱性染料。两者都能与DNA及RNA结合，只是亲和力有所不同。甲基绿和吡罗红混合染色时分别与DNA和RNA特异性结合可能与DNA和RNA不同的聚合度有关。在合适的pH条件下（约为4.8）混合染色时，两种染料与核酸的结合有竞争作用，甲基绿易与聚合程度高、负电性强的DNA竞争结合，呈现绿色或蓝绿色，而吡罗红则易与聚合程度较低、负电性相对较弱的RNA（核仁、细胞质中的RNA）竞争结合，呈现红色，此外解聚的DNA也能与吡罗红结合呈现红色或紫色。若盐酸解离过度或材料不够新鲜，导致DNA降解，也易使细胞核呈紫色。

结合上述实验效果验证，DNA与RNA都可以与甲基绿结合而呈绿色或都可以与吡罗红结合呈红色。例1中试题的相关选项的观点有待商榷。另外，细胞核中DNA的量多而密集，故甲基绿、吡罗红单独染色时，细胞核都易被染成较深的绿色或红色，在显微镜下很容易观察。

5.实验结论与教学建议

本实验目的是利用甲基绿和吡罗红对DNA和RNA的亲和力差异，以显示DNA和RNA在细胞中的分布，由于甲基绿和吡罗红对DNA和RNA染色仅仅是亲和力差异，但特异性结合不强，所以在实际操作中细胞核容易出现两种颜色混合的现象，难以达到较好的实验效果。在实验教学中，教师可以顺势引导学生深入探讨相关原理，鼓励学生进一步对实验进行分析和探究，将简单的重复验证教材实验变为趣味性、科学性更强的探究性活动，培养学生的科学思维和科学探究能力，这也顺应了高考注重科学探究素养的考查，促进学生学核心素养的养成。