超高效液相色谱-串联质谱法快速测定酒中的次乌头碱、乌头碱、中乌头碱

黄思瑜 董宪兵 邓宇杰 普正佳 田 圆 汪 敏

（重庆市食品药品检验检测研究院 重庆 401121）

1 前言

乌头碱、次乌头碱、中乌头碱是存在于川乌、草乌、附子等植物中的主要有毒成份[1-4]。它们主要毒性作用是影响中枢神经系统和心脏，据估计，口服乌头碱 2～3 mg 就可致人死亡[5]。但川乌、草乌、附子是中医临床常用中药，民间常用草乌、川乌等植物来泡制药酒，治疗关节炎、风湿病等。但如果使用未炮制的乌头碱类药材、乌头碱类药材自行泡制药酒，常导致中毒事件的发生[6]。因此，建立药酒中乌头碱、次乌头碱、中乌头碱的检测方法对药酒的安全性评价具有重要意义。乌头碱类药物常用的检测方法有双光束紫外-可见分光光度计[7-9]、薄层色谱法[10-13]、高效液相色谱法[14,15]、毛细管电泳场技术[16,17]、液相色谱-质谱法等[18-20]。本文采用高效液相色谱-串联质谱法对药酒中乌头碱、次乌头碱、中乌头碱的分离和分析方法进行了研究，建立了定量及定性同时开展的快速方法。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

美国Waters 公司 Acquity UPLC 超高效液相色谱仪；美国AB SCIEX 公司API4000 三重四级杆串联质谱仪（配备电喷雾离子源）；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；乙酸铵（色谱纯，美国天地试剂公司）；次乌头碱、乌头碱、中乌头碱均购于中国药品生物制品检定所。

2.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量次乌头碱、乌头碱、中乌头碱标准品适量于100 mL 容量瓶，用乙腈溶解，并定容至刻度。配制成浓度为1.0 mg/mL 的标准储备溶液，-18℃避光保存。准确移取次乌头碱、乌头碱、中乌头碱标准储备溶液1 mL 至100 mL 容量瓶，用乙腈稀释定容，得到10 μg/mL 的混合中间标准溶液，4℃保存。用空白基质溶液逐级稀释混合中间标准溶液，得到 10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L浓度系列。

2.3 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温:40℃；流速:0.3 mL/min；进样量:5 μL。流动相:乙腈:10 mmol/L 乙酸铵水溶液（氨水调节 pH9.5）=50：50（V/V）。

2.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源；扫描方式:正离子扫描；检测方式:多反应监测MRM；喷雾电压:5 500 V，离子源温度:550℃；监测离子对:次乌头碱616.4/524.4、616.4/556.3，乌头碱 646.3/586.3、646.3/368.3，中乌头碱 632.3/354.3、632.3/572.4。

2.5 样品处理

取1mL 样品过0.22μm 尼龙微孔滤膜，上机测定。

3 结果

3.1 方法的线性范围和定量限

在设定色谱、质谱条件下，用空白基质配制系列浓度的标准溶液并进行测定，以峰面积(Y)对应相应浓度（X）绘制标准工作曲线，外标法定量，计算回归方程。从表1可以看出，次乌头碱、乌头碱及中乌头碱标准系列溶液的浓度与色谱峰面积在0～1 000 μg/L 呈良好线性关系，相关系数（r）在 0.999 以上。用空白基质溶液配制标准溶液进行检测，按照信噪比S/N（S 为电子系统中的信号；N 为电子系统中的噪声）=3 计算次乌头碱、乌头碱及中乌头碱的检出限（LOD值），S/N=10 计算定量限。

表1 次乌头碱、乌头碱及中乌头碱标准标准曲线的线性关系和检出限

3.2 准确度与精密度

在空白样品中加入适量混合中间标准溶液，使加标量为 1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L，按照前述样品处理方法进行测定，每个添加水平测定6 次，加标回收率为94%，95%和100%，相对标准偏差分别为3.50%，2.44%和0.55%。

3.3 流动相的选择

由于乌头类生物碱对pH 较敏感，考察了流动相pH 值对3 种化合物分离度的影响。乌头碱类化合物为生物碱类化合物，在碱性条件下分离更好，因此比较了流动相 pH=7、pH=8、pH=9.5 条件下的分离和保留情况。结果发现，在pH=9.5 的情况下分离最好，3 种化合物离子色谱图详见图1。

3.4 标准溶液基质的选择

由于酒中含有乙醇，进行质谱测定时，可能会产生基质效应。比较水溶液配置标准曲线与空白基质溶液配置标准曲线，结果发现，基质溶液对响应值有一定的抑制作用，因此，选用空白基质溶液配置标准曲线。

3.5 实际样品分析

用本方法对重庆城区餐饮自制药酒共35 份样品进行检测。结果表明，有5 份样品检出乌头类生物碱，检出率为14.2%。其中，乌头碱均未检出，次乌头碱有2 份样品有检出，中乌头碱有3 份样品有检出，检出值均小于 10 μg/L。

图1 MRM 模式下标准溶液离子色谱图

4 结语

本文采用高效液相色谱-串联质谱法对药酒中乌头碱、次乌头碱、中乌头碱的分离和分析方法进行了研究，建立了定量及定性方法。本方法操作简单、定性、定量准确，可以用于药酒中乌头碱、次乌头碱、中乌头碱的检测。