绿茶浸出液对烘焙蛋糕中微生物的抑制作用

郭宇华

（北京市第四中学，北京 100089）

为了延长糕点保存期，人们日常生活中所食用的蛋糕、蛋黄派等糕点中或多或少添加了防腐剂，如山梨酸钾、丙酸钙、脱氢乙酸钠等，这些防腐剂使用不当会有一定的副作用[1]。随着人们生活水平的不断提高和消费者对健康的日益关注，人们对防腐剂应用的安全性提出了更高的要求。因此，广谱、高效、低毒的天然防腐剂的开发逐渐成为研究的热点。

大量研究表明，茶多酚对食源性致病菌、口腔病原菌、农作物致病菌及病毒等均有抑制作用[2]，可抑制食品中的腐败菌的生长[3-4]。儿茶素是茶多酚的主体成分，EGCG是儿茶素中含量占比最多以及抗氧化作用最强的一种成分，大量动物实验和临床实践已证明EGCG具有多种功效[5]，属非酶抗氧化剂[4]，具有优良的抗氧化能力。目前，糕点市场开发了一些含茶糕点，如抹茶蛋糕、绿茶馅糕点等，但多以研究其生产加工、制作工艺为主，少有从防腐、抑菌角度对绿茶在糕点中的作用进行相关研究。为此，文章制备不同浓度的绿茶浸出液，并添加到糕点中，通过微生物培养实验比较其抑菌效果，为开拓天然防腐剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂与培养基

实验所用水为娃哈哈纯净水。除特殊规定外，所用试剂为分析纯。色谱纯乙腈、0.9%无菌生理盐水、冰乙酸、正己烷、EGCG标准品（纯度95%）。培养基产自北京陆桥技术有限责任公司，培养基名称及用途参见表1。

表1 试验所用培养基Table 1 Medium used in the experiment

1.1.2 仪器与设备

SPX-150B生化培养箱（湖南力辰仪器科技有限公司），烤箱 （北美珠海电器有限公司VTO-34A）。

1.1.3 原辅料

炒青绿茶（质量等级五级）、小麦粉（低筋粉）、绵白糖（优质）、奶粉（优质）、食盐（精制盐）、食用油（一级压榨）、泡打粉（食品级）。

1.2 试验方法

1.2.1 添加剂使用现状调查

选择沃尔玛超市、BHG超市、家乐福超市等地进行预包装糕点抽样调查。统计目前市售糕点中所使用的食品防腐剂的种类及数量，从而了解其在烘焙食品中应用的现状。

1.2.2 绿茶浸出液的制作

依次称取2 g、5 g、10 g炒青绿茶，分别加入100 mL纯净水煮沸10 min，制成不同茶水比绿茶浸出液，分别为茶水比 1∶50、茶水比 1∶20、茶水比1∶10，121℃高压灭菌 20 min后备用。

1.2.3 绿茶浸出液中EGCG含量测定[6]

绿茶浸出液中的EGCG用正己烷/水萃取后，用C18柱测定，等度洗脱进行HPLC分析，检测波长280 nm，用EGCG标准品外标法直接定量。流动相流速为0.8 mL/min，柱温为30℃，流动相A为乙腈，流动相B为含2%冰乙酸的纯净水。

1.2.4 平板抑菌实验

以100 cfu/mL的大肠杆菌菌悬液作为试验菌，分别进行茶水比 1∶50（A 组）、茶水比 1∶20（B组）、茶水比 1∶10（C组）绿茶浸出液的抑菌试验。实验中绿茶浸出液的添加量分别为1 mL和2 mL，与0.5 mL大肠杆菌菌悬液 （浓度为100 cfu/mL）混匀后，倒入15～20 mL平板计数琼脂摇匀。待培养基凝固后，将所有平皿放入37℃恒温培养箱中，培养48 h后进行菌落观察并计数。每个试样需要进行3块平皿培养，计数。最终统计3块培养平板菌落的平均值。

1.2.5 绿茶蛋糕制作

采用麦芬蛋糕制作方法：依次称取低筋小麦粉 400 g、绵白糖 120 g、泡打粉 24 g、盐 5 g、鸡蛋80 g、植物油120 g于洁净容器中，搅拌成糊状，并分成4组。在对照试验组中添加纯净饮用水80 mL制成空白组。试验组选用3个不同茶水比1∶50（a 组）、1∶20（b 组）、1∶10（c 组）的组别，分别添加不同浓度绿茶浸出液80 mL，搅拌均匀后分装于蛋糕模具中。在200℃烤箱中，烤制15 min。

1.2.6 绿茶蛋糕抑菌效果研究[7]

（1）菌落总数测定

菌落总数的检测参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法进行。分别称取25 g各组样品放入无菌均质袋中，加入225 mL无菌生理盐水拍打，制成稀释梯度为1∶10样品悬浊液并震荡均匀；再用1mL无菌吸管吸取1mL样品悬浊液，无菌操作移至9 mL无菌生理盐水试管中震荡均匀，制成1∶100的样品悬浊液。取1mL各组悬浊液加入到无菌培养皿中，倒入平板计数琼脂摇匀。在37℃恒温培养箱中培养48 h后进行菌落观察与计数。将各组蛋糕放在室温（25℃）环境下，每间隔一天，进行复检培养实验，观察放置5天内样品菌落生长情况。

（2）大肠菌群检测

取10 mL各组样品10-1稀释梯度的悬浊液加入到10 mL双料乳糖胆盐发酵管中；取1 mL大肠杆菌悬浊液加入10 mL单料乳糖胆盐发酵管中；每一稀释度接种三管，置于37℃恒温培养箱中培养24 h后，观察菌落形态，挑取可疑大肠菌群菌落进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于37℃恒温培养箱中培养24 h。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告为每100 g大肠菌群的MPN值。每间隔一天，进行复检培养实验一次，观察放置5天后样品大肠菌群情况。

2 结果与分析

2.1 市售预包装糕点中防腐剂添加与使用情况分析

从北京市多家超市售卖的50种糕点商品成分标签中，观察配料表中标注的防腐剂主要有山梨酸钾、丙酸钙、脱氢乙酸钠3种成分。超过一半的糕点商品添加了丙酸钙，添加了山梨酸钾和脱氢乙酸钠的糕点商品分别占28%和24%。还有20%的糕点商品中未标注。

当产品需要较长时间的保质期时，添加1种防腐剂往往是不够的，在调查的糕点商品中只添加了1种防腐剂的占60%。同时，为了使各种防腐剂的含量都符合标准，产品中往往加入2种或2种以上的防腐剂，有16%的糕点添加了2种防腐剂，有4%添加了3种防腐剂。

此外，还调查了蛋糕的保质期，64%的糕点保质期在3～5天，14%的糕点保质期在6～10天，6%的糕点保质期在11～30天，4%的糕点保质期在31～90天，10%的糕点保质期在 120～180天，这些糕点所添加防腐剂种类多为1～2种。2%的糕点保质期超过180天，这些糕点需要添加更多防腐剂。

2.2 绿茶浸出液中的EGCG含量

三种不同茶水比绿茶浸出液中EGCG含量的检测结果如表 2 所示， 茶水比 1∶50、1∶20 和 1∶10三种绿茶提取液中EGCG含量分别为1.80 mg/L、3.18 mg/L和4.70 mg/L，绿茶浸出液茶水比比值越高，提取物中的EGCG含量越多，其抑菌能力越强。

表2不同茶水比绿茶浸出液中EGCG含量Table 2 EGCG content in each green tea extract with different ratio of tea to water

2.3 绿茶浸出液的抑菌效果

不同茶水比的绿茶浸出液对大肠杆菌的抑菌效果如表3所示。阴性对照组中，只添加了绿茶浸出液，而未添加大肠杆菌菌悬液，经过菌落培养，未有菌落检出，说明绿茶浸出液处于无菌状态。在阳性对照中，只添加0.5 mL的大肠杆菌菌悬液，通过培养菌落多到无法计数，以此确定大肠杆菌菌悬液的浓度适宜，符合实验要求。

结果表明，A、B、C三组的绿茶浸出液对大肠杆菌均有抑制作用。在同一浓度下，添加2 mL绿茶浸出液的抑菌效果比1 mL的抑菌效果明显。随着绿茶浸出液的浓度增高，EGCG含量的增多，浸出液的抑菌效果随之增强。添加2 mL的C组绿茶浸出液的菌落数量最少，对大肠杆菌的抑菌效果最佳。

2.4 绿茶蛋糕中微生物培养情况分析

将制作好的对照组及各实验组的蛋糕，提取悬浊液并稀释后，进行连续5天的微生物培养实验，菌落总数及生长情况如表4所示。蛋糕制作当天，各实验组均无菌落产生；第2天对照组开始有菌落检出，a组菌落略有增长，b、c组未见菌落增长；第3天对照组菌落大量产生，且多至不可计。而添加绿茶浸出液的三个试验组都表现出一定的抑菌效果，c组的抑菌效果尤为明显。当达到第5天时，所有试验组蛋糕中的菌落总数均不可计数。

表3不同浓度和添加量的绿茶浸出液对大肠杆菌的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of green tea extract with different concentration and additive amount onEscherichia coli

表4 各实验组样品菌落生长情况Table 4 Colony growth of samples in eachexperimental group

2.5 绿茶蛋糕中大肠菌群测定

所有实验组蛋糕在五天内乳糖胆盐发酵管均未产气，各实验组大肠菌群均小于30 MPN/100g。符合检验标准[7]。

3 讨论

对市售50种糕点防腐剂使用情况调查，发现当食品需要较长时间的保质期时，市场上的糕点通常会添加两种或两种以上的防腐剂，且主要添加的防腐剂为山梨酸钾、丙酸钙、脱氢乙酸钠。绿茶浸出液的平板抑菌试验表明，不同浓度的绿茶浸出液对大肠杆菌均有明显的抑制效果，其中添加2 mL茶水比为1∶10的绿茶浸出液的抑菌效果最佳；此外，在热加工糕点中添加绿茶浸出液能有效提高糕点的抑菌能力，茶水比1∶10试验组蛋糕的抑菌效果最优。目前，市场上绝大多数糕点的保质期为3～5天，而绿茶浸出液的有效抑菌时间在3天左右，能够接近工业制造使用防腐剂效果。研究通过实验表明，绿茶浸出液对大肠杆菌具有明显的抑制作用，将绿茶浸出液添加于烘焙糕点中，能有效地减缓糕点中大肠杆菌的生长，并减少或者替代工业防腐剂的使用，具有一定的应用前景。

研究只涉及绿茶浸出液对热加工糕点中微生物的抑制作用，下一阶段，可以根据热加工糕点的口感完善添加绿茶浸出液的量和茶水比，并进一步开发绿茶提取物在食品领域的潜能。