奶粉中阪崎克罗诺杆菌耐干燥性与MLST分型的研究

高建欣，杜欣军，李萍，王硕

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津 300071）

阪崎克罗诺杆菌是一种条件性食源致病菌，其感染已经被认为是最常见的危及生命的病例，可以导致婴儿脑膜炎、败血症、坏死性小肠结肠炎和系统性脓毒疾等疾病[1]。很多报道指出，婴儿配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是阪崎克罗诺杆菌的主要来源和载体[2-3]。因此，许多国家对于PIF 中这种病原体的监测越来越重视。在PIF 生产过程中，前期的巴氏消毒法能够灭活所有的阪崎克罗诺杆菌，但加入的配料不能用于巴氏消毒，加入被污染的配料可能导致该菌在成品奶粉中出现，另外加工设备不经灭菌处理，也可能是导致婴儿配方奶粉污染的重要原因[4]。在2010年和2012年，Li 等[5]对中国陕西省12 个城市的705 种零售牛奶婴幼儿食品样品中的阪崎克罗诺杆菌流行情况进行了调查，其中19 种样品阪崎肠杆菌为阳性，感染率为16.9%。这为阪崎克罗诺杆菌广泛的发病率提供了新的流行病学证据，说明消费者存在非常大的潜在健康风险。阪崎克罗诺杆主要导致早产儿或婴幼儿患病[6]，对其他年龄阶段的人也有致病性，特别是免疫力低下的成年人或老人[7]。但阪崎克罗诺杆菌是如何开始感染宿主细胞的目前仍不清楚[8-9]。阪崎克罗诺杆菌具有一些重要的与毒力或应激生存相关的因子，其中最重要的是耐干燥和渗透压能力相关的因子，使其能够在各种不利环境条件下持续生存[10]，在婴儿配方奶粉中长时间存活的能力是阪崎克罗诺杆菌致病机制比较根本的特性[11]。这种强大的生存能力，以及感染婴儿后高达80%的死亡率，也是使阪崎克罗诺杆菌作为新兴的胃肠道病原体得到广泛的关注的重要原因[12]。本研究通过干燥试验筛选出了耐干燥能力较强和较弱的阪崎克罗诺杆菌菌株，并通过多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）对所有菌株的分子流行特征进行研究，以期获得阪崎克罗诺杆菌耐干燥性与MLST 分型之间的关系，为进一步开展奶粉的安全控制、阪崎克罗诺杆菌的分子流行病学研究以及防控耐干燥菌株的暴发流行提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

35 株阪崎克罗诺杆菌分离株均为天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室保存菌种，如表1所示。本试验所用到的菌株，已经过16s rRNA 基因测序与生理生化鉴定，确定为克罗诺杆菌属中的阪崎克罗诺杆菌。所有菌株用甘油溶液保存于-80 ℃冰箱。

表1 本研究中用到的阪崎克罗诺杆菌菌株Table 1 C.sakazakii Strains used in this study

1.2 仪器设备和试剂

HVA-85 全自动压力蒸汽灭菌锅：日本Hirayama；5418R 台式冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；TProfes sional Thermal Cycler PCR 仪：美国 Biometra 公司；Gel Doc 2000 凝胶成像仪：美国Bio-Rad 公司；Sunrise Basic 酶标仪：Tecan，Austria；DYY-6C 电泳仪：北京六一仪器厂；96 孔细胞培养板：韩国SPL Life Sciences 公司。细菌DNA 提取试剂盒：北京天根生物有限公司；胶回收试剂盒、DNA 提取试剂盒：美国Omega Bio-Tek公司；蛋白胨、酵母浸取物：Oxoid 公司；NaCl：国药集团化学试剂有限公司；Agar Power：北京索莱宝科技有限公司；所需引物均由金唯智生物有限公司合成。

1.3 耐干燥能力强阪崎克罗诺杆菌菌株的筛选

将实验室保存的35 株阪崎克罗诺杆菌，在LB（luria-bertani，LB）固体培养基上三区划线，37 ℃培养12 h～18 h，挑取单克隆菌落，转接至含有1 mL LB 液体培养基的96 深孔板中，37 ℃，200 r/min 过夜培养。然后，以1 ∶100 的体积比将菌液转接至新的96 深孔板中，于 37 ℃，200 r/min 培养 2 h～3 h，用紫外分光光度计测其OD600值，并通过稀释将所有菌株的OD600值达到0.6 左右。吸取10 μL 菌液于96 细胞培养板中，每个菌株重复3 次。后将96 细胞培养板置于灭菌的干燥器中（内有500 g 脱水硅胶）。最后，把置有96 细胞培养板的干燥器放于培养箱中，45 ℃培养3 h，待菌液完全干燥后将培养箱温度调至25 ℃，继续干燥6 d。期间，分别在干燥第1 天、第6 天时各取出1 个96 细胞培养板，吸取100 μL LB 液体培养基于每孔中，37 ℃，200 r/min 培养 3 h，测取 OD600值。

1.4 阪崎克罗诺杆菌的MLST分型

1.4.1 阪崎克罗诺杆菌DNA 的提取

利用细菌基因组DNA 提取试剂盒对实验室保存的阪崎克罗诺杆菌菌株的基因组DNA 进行提取，试验操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4.2 阪崎克罗诺杆菌管家基因的扩增及测序

结合参考文献[13]和MLST 数据库的资料，选取阪崎克罗诺杆菌ATCC BAA-894 的7 个管家基因作为目的基因：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和 pps，分别编码ATP 合成酶β-亚基、伸长系数、谷氨酰-tRNA 合成酶、谷氨酸合酶大亚基、DNA 促旋酶B、翻译起始因子IF-2 和磷酸烯醇式丙酮酸合酶。基因位点和引物名称、序列及其片段大小见表2。

表2 阪崎克罗诺杆菌中7 个管家基因扩增和测序引物Table 2 Oligonucleotide primer sequences for the amplification and sequencing of the seven loci from genes in C.sakazakii

7 个管家基因所用的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）体系经优化后，最终确定为 25 μL扩增体系。PCR 扩增程序为，94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸，总共 30 个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳呈现，目标条带大小参照DNA Marker 指示，条带单一且明亮，则可进行后续的扩增产物纯化及测序分析。

PCR 产物的测序工作委托金唯智生物有限公司完成。使用测序引物对目的片段的DNA 序列进行双向测序，产物由3730xl DNA Analyzer 进行分析。

1.4.3 阪崎克罗诺杆菌管家基因的序列编辑及分型

将所得的阪崎克罗诺杆菌7 个管家基因序列进行拼接，并提交MLST 数据库进行比对，每个菌株可以得到相对应的各个等位基因的序列号，7 个管家基因的等位基因序列编号组合即为该菌株的ST 型。

1.5 系统发育树的绘制

将所有菌株的7 个等位基因序列按一定顺序串联起来，使用Mega 6.0 对序列进行比对，并采用Neighbour-Joining 法构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 阪崎克罗诺杆菌耐干燥性比较

本试验对35 株阪崎克罗诺杆菌进行了干燥试验，试图筛选出其中抗干燥能力较强的菌株，见图1。

图1 阪崎克罗诺杆菌干燥6 d 的失活率Fig.1 The inactivation rate of Cronobacter sakazakii after drying for 6 days

结果表明 1 号（IQCC10409）、6 号（IQCC 10455）和31 号（110609-3）菌株在第6 天表现出较其他菌株更强的抗干燥能力（如图1），经过6 d 处理失活率分别为63.73%、56.94%和 44.43%。而2 号（IQCC10410）、11号（ENS6309-4）和 17 号（ATCC 12868）菌株在第 6 天表现出较其他菌株较弱的抗干燥能力，经过6 d 处理失活率分别为91.54%、96.06%和96.75%。因此，31号菌株耐干燥能力最强。

2.2 阪崎克罗诺杆菌的MLST分型

将35 株阪崎克罗诺杆菌菌株进行MLST 分型，一共得到了16 个不同的ST 型，如表3所示。

表3 阪崎克罗诺杆菌分离株MLST 分型结果Table 3 MLST result of C.sakazakii isolates

其中，属于 ST1 型（20、24、27、28、33）和 ST4 型（4、6、7、9、11）的菌株较多，分别有 5 株菌，各占总菌株的14.3%；属于ST73 型和ST199 型分别有3 株，占总菌株的8.6%；属于ST8 型有2 株，占总菌株的5.7%；此外，还包含 ST23、ST136、ST266、ST13、ST40、ST60、ST240、ST373、ST223、ST442、ST282 型以及 6 株未能在数据库中找到的新ST 型。

续表3 阪崎克罗诺杆菌分离株MLST 分型结果Continue table 3 MLST result of C.sakazakii isolates

耐干燥能力较强的1号（IQCC10409）、6 号（IQCC10455）、和31 号（110609-3）菌株分别属于ST73、ST73 和 ST23 型，而耐干燥能力较弱的 2 号（IQCC10410）、11 号 （ENS6309-4） 和 17 号（ATCC 12868）菌株分别属于ST1、ST8 和ST282 型。结合耐干燥能力与MLST 分型可知，阪崎克罗诺杆菌基因多样性程度较高，其中，ST73 型耐干燥能力较强。另外，将试验所用35 株菌的耐干燥能力进行排序，其中耐干燥性较强的菌株中ST4 型有5 株，ST73 型有2 株；耐干燥性较弱的菌株中ST1 型有5 株，ST199 型有3 株。说明ST4 型菌株表现出较强耐干燥能力，而ST1 型耐干燥能力较弱。另外，通过比较不同菌株的耐干燥能力，发现即使相同ST 型的菌株，其耐干燥能力也不同，说明不同的阪崎克罗诺菌株间存在较强的个体差异性。

2.3 MLST分型与耐干燥的相关性

利用Mega 6.0 软件分析阪崎克罗诺杆菌菌株MLST 分型数据所得到的系统发育树见图2。

图2反映了菌株之间的亲缘关系的远近，可以直观地表现出分型与耐干燥之间的联系。通过分析某些特定的ST 型和相关耐干燥模式之间的联系，MLST 可能成为追溯阪崎克罗诺杆菌耐干燥菌株来源的有力工具，本研究中所涉及阪崎克罗诺杆菌菌株呈现出较高的基因多样性，不同来源的阪崎克罗诺杆菌分属于较为广泛的ST 型中。

3 讨论

阪崎克罗诺杆菌具有多种致病因子，能引起危及生命的疾病、严重的慢性后遗症或是长时间的疾病。很多报道指出，PIF 是克罗杆菌属的主要来源和载体[14-15]。因此，许多国家对于PIF 中这种病原体的监测已经越来越多重视。此外，阪崎克罗诺杆菌是一种抗干燥能力较强的菌种，能在奶粉中长期存活，其易在奶粉复水时大量繁殖。因此，研究阪崎克罗诺杆菌的分型与其耐干燥性的关系非常重要。本研究中，Cronobacter sakazakii IQCC10409、Cronobacter sakazakii IQCC10455 和 Cronobacter sakazakii 110609-3 菌株的抗干燥能力较强（如图1），其中Cronobacter sakazakii 110609-3 菌株耐干燥能力最强，属于ST23 型，而Cronobacter sakazakii IQCC10409 和 Cronobacter sakazakii IQCC10455 也表现出较强的耐干燥能力，它们都属于ST73 型，这说明ST73 型属于耐干燥能力较强的MLST 型。另外，对试验所用35 株菌的耐干燥能力进行排序，耐干燥性较强的菌株主要集中于ST4型。Fei Peng 等[16]研究表明ST4 型耐干燥能力较强，与本试验结果一致。这可能解释ST4 型阪崎克罗诺杆菌是从婴儿配方奶粉中分离出来的常见基因型的主要原因之一。以上的研究不仅有助于更好地了解阪崎克罗诺杆菌的在食品环境中的存活性，还有助于为分子流行病学调查以及预防和控制该菌的流行提供支持。

图2 阪崎克罗诺杆菌菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of C.sakazakii isolates