葡萄汁有孢汉逊酵母β-葡萄糖苷酶的提取与纯化

李爱华 孙玮璇 李 萍 陶永胜* 梁艳英

（1 西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西杨凌712100 2 西北农林科技大学葡萄酒学院 陕西杨凌712100 3 宁夏出入境检验检疫局 银川750001）

葡萄酒的典型香气特征取决于葡萄浆果中的品种香气成分， 这些品种香气成分在葡萄果实中绝大多数以糖苷结合态的形式存在[1]。结合态芳香物质不具有挥发性，无气味，只有经过酿酒过程中的酶促水解释放出游离态的香气成分， 才能表现出典型的香气特征[2-3]。 香气糖苷酶促水解过程中的关键酶是β-葡萄糖苷酶[4-6]。 葡萄浆果与酿酒酵母是酿酒过程中β-葡萄糖苷酶的两大重要来源，其典型的酿酒环境，高糖、高酸、高酒精度、高含量多酚成分，对这两个来源的β-葡萄糖苷酶活性有很强抑制作用， 因此酿造过程中大多数风味前体物未被释放[7-9]，尤其对于不完全成熟的原料。添加外源糖苷酶，促进香气糖苷的水解，受到酿酒师们的关注。

一些商业酶制剂被开发出来应用于葡萄酒的酿造过程，主要用于提高出汁率、澄清、增加香气等。 目前， 应用于葡萄酒酿造的酶制剂主要从真菌、霉菌中分离提取，例如AR2000 糖苷酶制剂来源于黑曲霉。 商业糖苷酶制剂中β-葡萄糖苷酶是其关键酶， 然而它们仍是一些非特异性葡聚糖酶的混合物，在促进香气糖苷水解的同时，可能会水解色素糖苷， 少量存在的肉桂酸酯酶还会水解酚酸类糖苷，增加挥发性酚类含量，带来不良气味[10-11]。大量研究表明， 某些非酿酒酵母菌株 （non-Saccharomyces）具有高活性的β-葡萄糖苷酶，它们在葡萄酒酒精发酵过程中的活动， 能够调整活性香气成分的含量，增加葡萄酒风味的复杂性[2，11-15]。有关优选非酿酒酵母菌株β-葡萄糖苷酶分离提取步骤的优化研究鲜有报道， 影响了优选非酿酒酵母菌株及其β-葡萄糖苷酶增香酿造特异性的理论分析。

本研究前期工作筛选获得一株高产β-葡萄糖苷酶的葡萄汁有孢汉逊酵母， 其糖苷粗酶提取液具有很好的酿酒环境适应性[16]。 本文研究该优选菌株β-葡萄糖苷酶的提取与纯化步骤，优化设计一套优选菌株β-葡萄糖苷酶的提取纯化工艺，为研究该酶的酶学特性和酿造特性提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 优选菌株

非酿酒酵母菌株为西北农林科技大学葡萄酒学院酿造与风味实验室筛选的葡萄汁有孢汉逊酵母， 中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC NO：M 2013658。

1.2 仪器与试剂

仪器：UV-2450 紫外分光光度计、AUY220 电子分析天平，日本岛津公司；HH-4 数显恒温水浴锅， 国华电器有限公司；5804R 台式冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；RC5CPLUS 冷冻高速离心机，美国Sorvall 公司；pHS-3C 精密pH 计，上海雷磁仪器厂；HZQ-F160 全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；TH-500 梯度混合仪、1.6 cm×50 cm 和1.0 cm×40 cm 层析柱、HD-A 层析图谱采集分析仪、HD-2 核酸蛋白检测仪、BT-100 恒流泵，上海沪西分析仪器有限公司。

试剂：考马斯亮蓝G-250，美国USB 公司；丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR、二乙基氨乙基高流速离子型琼脂糖凝胶（DEAE -Sepharose-FF），上海源叶生物科技有限公司；溴甲酚绿、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、对硝基苯酚，美国Sigma 公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、聚乙二醇20000（PEG），北京索莱宝科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化钡、琼脂、吐温8.0、碳酸氢钠、氯化铁、硫酸锰、无水碳酸钠、氯化钙、盐酸、一水合柠檬酸、无水乙醇、氢氧化钠、十二水磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、磷酸、氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸、甲醇、硫酸镁、硝酸铵、磷酸二氢钾等常规试剂，购于天津市天力化学试剂有限公司。

1.3 酶活的细胞定位

优选菌株在YEPD 液体培养基[17]上活化扩增后，接入未加吐温的YEP 培养基[18]中培养72 h，取2 mL 菌液离心10 min（4 ℃，10 000 r/min）得到菌体和菌液上清液。 菌体用0.15 mol/L 氯化钠溶液清洗2 次得到完整细胞。 将完整细胞悬浮在2 mL PBS buffer（NaCl 140 mmol/L， KCl 2.7 mmol/L， Na2HPO410 mmol/L， KH2PO4 1.8 mmol/L，pH 7.4）中，振幅为80 的超声波下破碎20 min，后离心10 min（4 ℃，10 000 r/min）得破碎上清液和破碎沉淀，β-葡萄糖苷酶活性采用pNPG 法测定[19]。

1.4 菌株发酵培养和粗酶液制备

用YEPD 培养基28 ℃、140 r/min 条件下振荡扩增培养72 h 后的菌液接入YEP 培养基，分别用8 层纱布和封口膜封口，28 ℃，150 r/min 条件下摇床培养，每24 h 进行细胞计数并测定酶活，观察144 h，研究通氧和厌氧条件下菌体增殖及产酶量的差异，确定最佳培养时间。

将优化培养条件下发酵得到的菌液进行离心处理， 收集的上清液， 对离心处理条件中温度（4℃和20 ℃）、时间（10 min 和20 min）和转速（8 000 r/min 和10 000 r/min）3 个因素各设置2 个水平，将上清液酶活性作为评价指标， 确定最佳的提取条件。其中，离心处理组1 的离心条件为20 ℃、10 min、8 000 r/min； 离心处理组2 的离心条件为20℃、10 min、10 000 r/min； 离心处理组3 的离心条件为20 ℃、20 min、8 000 r/min； 离心处理组4 的离心条件为20 ℃、20 min、10 000 r/min； 离心处理组5 的离心条件为4 ℃、10 min、8 000 r/min；离心处理组6 的离心条件为4 ℃、10 min、10 000 r/min；离心处理组7 的离心条件为4 ℃、20 min、8 000 r/min； 离心处理组8 的离心条件为4 ℃、20 min、10 000 r/min。

1.5 硫酸铵盐析沉淀

确定pH 值：取6 个离心管，每管装粗酶液4 mL，调整各管的pH 值分别为3.0～8.0，4 ℃冰箱放置2 h，10 000 r/min 条件下离心10 min，等体积柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解沉淀， 测定各管酶活，确定粗酶液最适pH 值。

确定盐析浓度：取8 个离心管加入粗酶液10 mL， 分别加入硫酸铵使其饱和度达到20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，4 ℃下静置过夜，离心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）分别收集上清液和沉淀，沉淀用等体积最适pH 值的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，测定上清液和沉淀的β-葡萄糖苷酶活性和蛋白质含量（考马斯亮蓝法），确定最佳盐析浓度。

1.6 层析纯化

上述蛋白的盐析沉淀用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（pH 5.0）溶解后装入透析袋，采用0.05 mol/L 乙酸-乙酸钠溶液（pH 5.0）4 ℃下透析除盐，每隔2 h 更换透析液，用硫酸钡检测脱盐效果。 脱盐酶液用PEG20000 浓缩至2 mL， 加入DEAESepharose-FF 层析柱 （pH 6.5 缓冲溶液平衡），首先用5 倍柱体积的缓冲液洗脱至基线平稳， 然后用含0～1mol/L 氯化钠的同种缓冲液梯度洗脱，流速为1.0 mL/min， 待检测有蛋白峰出现时收集洗脱液，每5 min 收集1 管，测定各管β-葡萄糖苷酶活性，酶活性较高的部分合并，用PEG20000 再次浓缩至2 mL。 加到缓冲溶液平衡好的Sephacry1 S-200 葡聚糖凝胶层析柱中，缓冲溶液洗脱，流速为0.4 mL/min，待有蛋白峰出现时开始收集，5 min收集1 管。测定各蛋白峰的酶活，最高峰即为目的蛋白。

1.7 数据分析

试验数据的图表分析采用Excel 2007 软件（Microsoft Office 2007 办公软件， 美国微软）处理。

2 结果与讨论

2.1 β-葡萄糖苷酶活性定位

目前有关微生物提取纯化β-葡萄糖苷酶的研究大多集中在霉菌、乳酸菌、酒酒球菌和酿酒酵母上，有关非酿酒酵母的报道很少[1，20-22]，直接对β-葡萄糖苷酶进行活性定位的报道更少， 相关报道均是通过离心获取粗酶液， 间接表达其为胞外酶[1，5，8]。本试验利用超声波破碎法对葡萄汁有孢汉逊酵母所产β-葡萄糖苷酶进行初步定位，结果如图1 所示， 菌液上清液中的酶活明显高于其他样品， 说明在葡萄汁有孢汉逊酵母产生的绝大部分β-葡萄糖苷酶都分泌到胞外，该酶是胞外酶，可通过离心提取粗酶液， 试验结果与目前运用离心取上清液提取酿酒酵母及非酿酒酵母中的β-葡萄糖苷酶的主流方法一致。 相比通过细胞破碎获取酒酒球菌[6，22]、乳酸菌[1，5]及霉菌[20-21]所产胞内β-葡萄糖苷酶的方法，葡萄汁有孢汉逊酵母所产β-葡萄糖苷酶的提取条件及所需设备更为简便， 更适于工业生产。

图1 葡萄汁有孢汉逊酵母β-葡萄糖苷酶酶活定位Fig.1 Enzyme localization of H.uvarum

2.2 β-葡萄糖苷酶最佳培养及提取条件

试验利用封口膜和纱布分别为葡萄汁有孢汉逊酵母营造厌氧和通氧的培养条件， 培养结果见图2。由图2（a）可知，纱布组与封口膜组细胞数变化规律基本相同，不同之处在于纱布组48 h 达最大值，而封口膜组在72 h 达最大值，纱布组达最大值后细胞数减少比封口膜组缓慢。图b 可见，两组酶活变化规律也基本相同，均在72 h 达到酶活最大值， 但纱布组最大值明显高于封口膜组。 因此，选用纱布封口（即通氧条件）更适于葡萄汁有孢汉逊酵母发酵培养，最佳培养时间为72 h。

图2 厌氧、通氧条件下葡萄汁有孢汉逊酵母细胞生长（a）和酶活变化（b）曲线Fig.2 Cell growth curve （a）and β-glucosidase activity curve （b）of H. uvarum at anaerobic and oxygenation conditions

从培养时间看， 葡萄汁有孢汉逊酵母在72 h时达到培养液中最大的β-葡萄糖苷酶酶活，比文献中其他菌种的培养时间明显缩短[5-8，21，23]。 虽然YEPD 培养基中酿酒酵母最大β-葡萄糖苷酶酶活的培养时间与非酿酒酵母相似[3，12]，但其所产糖苷酶在典型酿酒环境下的活性较低。 不同离心条件下β-葡萄糖苷酶的相对酶活关系如图3 所示，可见不同处理的酶活相差很大，处理6（4 ℃、10 000 r/min，10 min）所得酶液中β-葡萄糖苷活性最高，即为该酶的最佳提取条件。

2.3 β-葡萄糖苷酶纯化

图4 所示不同pH 值缓冲液下酶液中β-葡萄糖苷酶的活性，可见优选酵母分泌的β-葡萄糖苷酶的最适pH 值为5.0（见图4），所以确定硫酸铵沉淀所用缓冲液pH 值为5.0。 而后进行硫酸铵浓度梯度试验，确定沉淀所需最佳硫酸铵饱和度，由图5 可知， 当硫酸铵的饱和度达80%时沉淀中的β-葡萄糖苷酶活性最高， 确定用80%硫酸铵进行初步沉淀。

图3 不同离心条件下β-葡萄糖苷酶酶活Fig.3 Enzyme activity at different centrifuge conditions

硫酸铵溶液沉淀的β-葡萄糖苷酶通过两次不同的层析进一步纯化， 由图6a 可见，DEAESepharose-FF 离子交换层析的整个洗脱过程出现3 个主要的酶活变化峰，当洗脱液中氯化钠浓度达到0.45 mol/L 时，2 号峰对应馏分中β-葡萄糖苷酶的活性最高。 Sephacry1 S-200 葡聚糖凝胶层析纯化结果如图6b 所示，整个洗脱过程有2 个酶活变化峰，2 号峰对应馏分的酶活最高， 因此该峰对应的馏分为纯化的β-葡萄糖苷酶酶液。

图4 pH 对β-葡萄糖苷酶活影响Fig.4 The effect of pH on β-glucosidase activity

图5 硫酸铵饱和度对β-葡萄糖苷酶沉淀的影响Fig.5 Effect of ammonium sulfate saturation on enzyme precipitation

图6 β-葡萄糖苷酶离子交换层析（a）和葡聚糖凝胶层析（b）Fig.6 Ion-exchange chromatography （a）and gel filtration （b）of β-glucosidase

经纯化所得β-葡萄糖苷酶的酶液在各步骤中的纯化收得率分析见表1，与粗酶液相比，纯化酶液中β-葡萄糖苷酶的酶活提高了24.56 倍，酶的回收率为6.91%。 本试验结果比Dong M[22]、Guo Y[23]、Gao L[24]等的纯化效果较好，但本试验中β-葡萄糖苷酶的回收率只有6.91%， 有待进一步研究提高。

表1 纯化收得率表Table 1 Purification protocol for the β-glucosidase

3 结论

本试验以优选葡萄汁有孢汉逊酵母β-葡萄糖苷酶为试验对象， 利用超声波破碎法对其进行活性定位， 并对提取纯化各步进行摸索确定最佳条件。 结果显示，葡萄汁有孢汉逊酵母β-葡萄糖苷酶为胞外酶，可通过离心直接提取。其最佳培养及提取工艺为： 纱布封口发酵培养基中振荡培养72 h，在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心10 min。 该酶经过80%硫酸铵盐析、 阴离子交换层析与凝胶层析三步纯化，β-葡萄糖苷酶活性提高了24.56倍，酶的回收率为6.91%。