具粘附特性的动物双歧杆菌对便秘模型小鼠血清中胃肠调节肽水平的影响

王琳琳 王 刚* 张 灏 赵建新 陈 卫，2

（1 江南大学食品学院 江苏无锡214122 2 食品科学与技术国家重点实验室 江苏无锡214122）

便秘 （constipation）是临床常见的多种疾病的一个症状，主要是指排便次数减少、频率低，在不使用泻剂的情况下， 每3～4 d 或更长的时间排便1 次，每周排便次数少于3 次，粪便量减少、粪便干结、排便费力、排便不尽，排便同时并伴有腹痛、腹胀等[1-2]。 便秘在人群中的患病率高达27%，然而只有一小部分便秘者会就诊。 便秘可以影响各年龄段的人。女性多于男性，老年多于青、壮年，而且随着年龄的增加，便秘也会逐渐加重[3-4]。其治疗的原则就是消除病因，改善症状，恢复正常肠动力和正常排便的生理功能， 因此是一个个体化的综合治疗过程[5]。目前用于治疗便秘的主要临床药物包括容积性泻剂、泻盐、渗透性泻剂、刺激性泻剂、润滑性泻剂等药物，这些药物或多或少都存在着价格昂贵，毒副作用大，易产生药物依赖，而且并不是对所有的患者都有效等问题。 长期使用刺激性泻药容易引起“泻剂结肠”，使得治疗便秘难度加大。临床研究表明：便秘患者肠道内存在严重的菌群失调， 通过给予益生菌对其局部的微生态环境进行调节，达到治疗便秘的目的，是目前该领域研究的新思路。

双歧杆菌是人体肠道中一种重要的优势菌群，每克肠内容物中约含108～1010个[6]，通过定植粘附在人的肠上皮细胞， 抵御外来病原菌及肠道有害菌的侵袭，起到占位性保护作用。 换言之，也就是起到生物屏障和生物拮抗作用。 这就要求其首先具有粘附于肠上皮细胞的特性。 本文假设具有粘附特性和不具备粘附特性的动物双歧杆菌对便秘小鼠的肠肽类递质的分泌影响不同， 本文的研究内容包括以下几个部分：1）所选两株动物双歧杆菌（CCFM 624，CCFM 625）体外耐受胃肠液情况；2）所选两株动物双歧杆菌 （CCFM 624，CCFM 625）体外粘附肠上皮细胞情况；3）所选两株动物双歧杆菌（CCFM 624，CCFM 625）对便秘小鼠健康指标和血清中胃肠调节肽分泌水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

BALB/c 雄性小鼠，7 周龄， 体重18～21 g，SPF 级，购自江苏苏州苏普斯实验动物技术中心；盐酸洛哌丁胺（2mg/胶囊）、酚酞（0.1 g，100 片）购自无锡大药房；胃肠调节肽：胃动素（MTL）、胃泌素（Gas）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、P 物质（SP）、内皮素（ET-1）、生长抑素（SS）和血管活性肠肽（VIP）试剂盒，购自上海文乐生物科技有限公司；MRS 培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。

SX-300 高压灭菌锅， 上海东亚压力容器制造厂；5415R 离心机 （Eppendorf），DG250 厌氧工作站， 英国DWS 公司；ZHJH-C1115B 型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；酶标仪，美国Thermo。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1）盐酸洛哌丁胺混悬液 （1 mg/mL）的配制：盐酸洛哌丁胺（2 mg/胶囊），取50 粒胶囊，将胶囊中的药物粉末取出混匀， 加无菌水至100 mL，临用前配制。

2）酚酞混悬液（7 mg/mL）的配制：酚酞片（0.1 g， 100 片），取7 片酚酞片用研钵研碎呈粉末后加水至100 mL，临用前配制。

3）双歧杆菌菌悬液的制备：将动物双歧杆菌CCFM625 发酵液于3 000 g 离心10 min， 用无菌的生理盐水洗菌泥2 次， 再3 000 g 离心10 min以便于获得纯的菌体。 将此菌体以30%蔗糖作为冷冻保护剂，保存于-20 ℃冰箱，经冻藏试验验证，2 周内所有菌株的数量均无明显下降， 灌胃前将其用无菌生理盐水配制成浓度为4×1010CFU/mL和4 ×108CFU/mL 的菌悬液用于动物试验。

阳性对照植物乳杆菌ST-Ⅲ 菌悬液的配制方法与双歧杆菌菌悬液的配制方法相同。

1.2.2 动物双歧杆菌耐受人工胃肠液情况研究人工胃肠液临用前新鲜配制。 将胃蛋白酶溶于pH 3.0 的PBS 中，使其最终质量浓度为3 g/L，经滤膜（0.22 μm）过滤后得到模拟胃液。 同理，将胰蛋白酶溶于pH 8.0 的PBS 中使其最终质量浓度为1 g/L，经膜（0.22 μm）过滤后制成模拟肠液[7]。

将培养到稳定期早期的动物双歧杆菌和植物乳杆菌用无菌生理盐水重悬后，分别取1 mL 加入9 mL 人工胃液中，然后将此培养液放置于37 ℃厌氧工作战中培养， 并分别在0，1，2 和3 h 取样1 mL 加入9 mL 无菌生理盐水中进行10 倍稀释，检测活菌数。 在人工胃液中培养3 h 后，取1 mL 加入9 mL 模拟肠液中， 混匀后分别在37 ℃厌氧工作战中培养2，4 和8 h，并于2，4 和8 h 分别取样1 mL 加入9 mL 无菌生理盐水中进行10 倍稀释，检测活菌数。 动物双歧杆菌的存活率按照下式进行计算：

式中：N1——经过模拟胃肠液处理之后的动物双歧杆菌活菌数，CFU/mL；N0——未处理前动物双歧杆菌活菌数， CFU/mL。

1.2.3 动物双歧杆菌对肠上皮细胞HT-29 细胞的粘附能力研究 将HT-29 细胞培养于含有10%（质量分数）胎牛血清和1%（质量分数）青链霉素的DMEM 培养液中， 于5%二氧化碳培养箱37 ℃传代培养，每隔一天换一次培养液；待细胞传代3～4 次并长满80%细胞培养板之后， 用胰酶消化，PBS 清洗后，离心，用DMEM 基础培养液调整细胞浓度为105细胞/mL，将此浓度的细胞培养液置于事先置入载玻片的细胞培养板中培养6 h，将培养至稳定期早期的2 株动物双歧杆菌和一株植物乳杆菌用DMEM 基础培养液调整到浓度为107CFU/mL， 并与上述的HT-29 细胞共培养3 h，PBS 清洗4 次，然后用甲醇固定5～10 min，甲醇的添加量以铺满细胞培养板为宜， 之后用姬姆萨染液进行染色；用PBS 洗液冲洗染液至无色，常温放置至自然干燥；取出载玻片，在100 倍的油镜下观察粘附强弱[8]，其中植物乳杆菌作为阳性对照。

1.2.4 动物试验设计 BALB/c 雄性小鼠，7 周龄，体重18～21 g，SPF 级，饲养于江南大学实验动物中心屏障环境，喂食标准配方小鼠辐照饲料，自由饮食饮水，12 h 交替照明， 温度控制在23℃±2℃，湿度为40%～60%。 动物试验符合国家《实验动物管理条例》和《江苏省实验动物管理实施办法》要求， 且本试验的所有协议均有江南大学伦理委员会批准（JN. No20150326-0110-21）。

BALB/c 雄性小鼠适应1 周后，对其进行随机分组，共分成7 组，分别为空白组、模型组、酚酞阳性对照组、植物乳杆菌ST-Ⅲ阳性对照高、低剂量组和动物双歧杆菌CCFM 625 高、 低剂量组。 第1～14 天，空白组、模型组灌胃无菌生理盐水 0.25 mL， 低剂量和高剂量组分别灌胃4×108、4×1010CFU/mL 的动物双歧杆菌 CCFM625 0.25 mL，植物乳杆菌ST-Ⅲ阳性对照低高剂量组同样分别灌胃4×108、4×1010CFU/mL 的植物乳杆菌 ST-Ⅲ0.25 mL， 酚酞阳性对照组灌胃7 mg/mL 的酚酞0.25 mL，每天一次，连续灌胃14 d，试验期间小鼠自由进食和进水。 第15 天开始造模，具体试验操作如下：除空白组灌胃无菌生理盐水以外，其余组均灌胃盐酸洛哌丁胺混悬液（1 mg/mL）0.25 mL，每天一次，连续灌胃3 天，第17 天晚上对小鼠进行为期18 h 的禁食。 并于第2 天早上处死小鼠，取血清，检测便秘相关胃肠肽递质的变化情况，试验具体分组及操作情况见表1。

1.2.5 血清学指标检测 室温血液自然凝固10～20 min 后，2 000～3 000 r/min 离心20 min。 仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 血清中便秘相关胃肠调节肽（胃动素（MTL）、胃泌素（Gas）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、P 物质（SP）、内皮素（ET-1）、生长抑素（SS）和血管活性肠肽（VIP））水平检测采用ELISA 试剂盒， 检测方法按照说明书进行。

表1 动物试验分组情况一览表Table 1 Specific arrangements of animal experiment

1.3 数据处理

应用origin 8.5 和GraphPad prism 5 画图，所有的数据采用SPSS 21.0 进行显著性分析，应用one-way ANOVA 对不同组进行比较， 所有数据均以±s 表示，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株体外耐受模拟胃肠液情况研究

所选的动物双歧杆菌在人工模拟胃肠液中表现出较好的耐受能力， 且所选各株菌在耐受人工胃肠液方面具有显著性差异（P<0.05），具体情况见表2。 动物双歧杆菌CCFM625 对人工胃肠液的耐受能力接近90%，显著大于阳性对照（ST-III），而动物双歧杆菌CCFM624 对人工胃肠液的耐受能力也达到了70%以上，由此可知：所选的两株动物双歧杆菌均能较好的耐受人工胃肠液。 胃液在空腹和饱腹条件下，其pH 范围在1～4 之间，食物停留在胃中的时间通常为20～30 min，胃液的低酸环境是大多数细菌通常无法耐受的， 然而这道屏障同时也会把有益菌拒之门外， 只有耐受胃酸的乳酸菌，才能通过人体的第一道屏障[9]。 通过胃液后，乳酸菌随着食物一起来到十二指肠，在这里，胆汁开始分解脂肪， 而大多数细胞的细胞膜恰恰是由脂肪组成的，因此，十二指肠也是大多数细菌的葬身之地，乳酸菌为了到达肠道，就必须要耐受十二指肠里的胆汁， 而只有耐受胆汁的乳酸菌才能继续进入肠道， 同时进入肠道的乳酸菌必须具有粘附肠上皮细胞的能力， 才能在肠道中定植并发挥其免疫调节作用[10]。

2.2 菌株体外粘附情况研究

通过对特定细胞系HT-29 的体外细胞粘附试验， 对上述2 株动物双歧杆菌菌株的粘附力的测定结果如表3。 可以看出，2 株动物双歧杆菌菌株与肠道上皮细胞的粘附能力不同，除CCFM625具有较强的粘附能力之外，CCFM624 不具备粘附的特性。CCFM625 粘附平均值在100 个细菌/细胞以上，而CCFM624 粘附平均值在10 个细菌/细胞以下。 这些结果表明双歧杆菌对肠道上皮细胞的粘附性存在着菌株差异性。研究表明：双歧杆菌对肠上皮细胞的粘附具有时间和浓度依赖性[11]，菌株差异性和种属依赖性[12]，宿主特异性[13]和可逆性[14]。 粘附是定植的第一步，不能粘附于肠道上皮细胞表面的细菌，只能作为过路菌，而不能在肠道内定植并进一步增生。

表2 动物双歧杆菌对模拟胃肠液的耐受能力Table 2 Tolerance of B. animalis strains in simulated gastric and small intestinal juices

表3 不同菌株对HT-29 细胞的粘附能力Table 3 Adhesion of different bacteria to HT-29 cells

2.3 小鼠健康指标的变化情况

小鼠的健康指标主要包括： 小鼠的体重、饮食、饮水情况。 由图1、表4 和表5 可以看出：喂食不同浓度的同种不同株的双歧杆菌以及植物乳杆菌后，小鼠的体重呈现增长的趋势，但是各组间并不具有显著性差异， 不同组间小鼠的饮食和饮水情况并没有显著差别，这些结果都与Ji Eun Kim[15]的报道相一致。

图1 小鼠体重变化情况Fig.1 The changes in body weight of mice

2.4 小鼠血清便秘相关胃肠调节肽指标的变化情况

经不同的动物双歧杆菌喂养过后的小鼠血清中便秘相关的胃肠调节肽的变化情况见表6。由表可知： 不同剂量的同种不同株的双歧杆菌对便秘小鼠血清中便秘相关指标的影响不同， 其主要表现是：便秘后，小鼠血清中兴奋性递质[16]（胃动素、胃泌素、乙酰胆碱酯酶和P 物质）呈现下降的趋势，抑制性递质[16]（内皮素、生长抑素和血管活性肠肽）呈现上升的趋势，其中模型组的兴奋性递质指标最低，抑制性递质指标最高，而经过动物双歧杆菌CCFM 625 和植物乳杆菌处理后的小鼠血清中兴奋性递质指标高于模型组， 而抑制性递质低于模型组。 不具备粘附特性的动物双歧杆菌CCFM 624 高剂量组处理过后的小鼠血清中兴奋性递质与便秘组无显著性差异， 低剂量组处理过后的小鼠血清中抑制性递质与便秘组无显著性差

异。结果表明：具有粘附特性的动物双歧杆菌喂食小鼠后， 可以调节小鼠血清中便秘相关胃肠调节肽的分泌， 主要是促进兴奋性递质的分泌和降低抑制性递质的分泌，且具有浓度依赖性。这些结果与其它一些学者的报道相一致[17-19]。MTL 影响水和电解质的运输，促进胃的收缩和小肠节段性运动，加速肠道传输时间和增加结肠运动。 Gas 刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌， 促进消化道黏膜上皮的生长，对胃肠道平滑肌的收缩和幽门括约肌松弛，调节胃肠道收缩、 肠蠕动和胃酸分泌。 因此，MTL，Gas 和SP 的血清水平的提升，促进肠道蠕动和内容物的传输。ET 作为一种多功能多肽，在心血管、神经内分泌和胃肠功能等多方面发挥重要作用[20]。 同时，它在血管张力的稳定和维持基本的心血管系统中起着重要的作用。 SS 抑制胃肠激素的释放，如MTL、Gas 和胃酸的分泌、胰蛋白酶和淀粉酶。 Vecht[21]表明，SS 可以明显减缓小肠通过时间，无论是否进食的情况下。 VIP 是由28 个氨基酸组成的多肽， 其功能是放松胃肠道和胃肠道括约肌， 并显著促进致癌物质对小鼠的致癌作用。Fasth 等[22]认为VIP 是产生下行抑制的重要因素，导致肠道转运缓慢。

表4 小鼠饮水情况Table 4 The drinking water status of mice

表5 小鼠饮食情况Table 5 The dietary condition of mice

表6 动物双歧杆菌对洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清学指标的影响Table 6 Effects of B. animalis on serum parameters in a loperamide-induced constipation model in mice

3 结论

本文以具有较强粘附肠上皮细胞能力和耐受胃肠液的植物乳杆菌ST-Ⅲ作为对照菌株，检测同种不同株的在粘附特性方面具有差异的动物双歧杆菌对便秘小鼠血清中胃肠调节肽的影响是否具有差异。研究结果表明：具有粘附特性的动物双歧杆菌可以显著提高血清中便秘相关兴奋性递质（MTL，Gas，AchE 和SP）的分泌，同时降低抑制性递质（SS，ET 和VIP）的分泌，且对便秘小鼠的健康指标没有显著性影响， 表现出较好的调节便秘相关血清学指标的作用， 说明具有粘附特性的动物双歧杆菌缓解便秘主要是通过纠正血清中便秘相关胃肠调节肽水平分泌至正常来达到的。 但其对结肠以及整个肠道的转运时间和粪便含水量的影响情况是下一步研究的重点。