超声波辅助提取红树莓籽中原花青素及其抗紫外活性评价

焦天慧 芦 宇 叶琳琳 姚 佳 庄 园 黄媛媛 赵旻阳 吕长鑫* 励建荣

（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程控制中心 辽宁锦州121013 2 辽宁辉山乳业集团（沈阳）有限公司 沈阳110121 3 锦州海关综合技术服务中心 辽宁锦州121013）

红树莓籽是红树莓在加工过程中产生的副产物，约占红树莓鲜果质量的10%。由于红树莓籽中含有原花青素、鞣花酸、黄酮等植物多酚[1]，因此，它可作为一种良好的天然抗氧化剂来源。 目前普遍采取丢弃或堆埋等手段对红树莓籽进行处理，导致红树莓籽利用率极低并对环境产生了污染[2]。原花青素（Proanthocyanidins）是一类有着特殊分子结构的生物类黄酮， 由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成[3-5]，广泛存在于植物果实、种子、花和果皮中。 原花青素具有抗衰老、抗肿瘤、抗紫外和防辐射等功能，已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域[6]。对原花青素提取主要通过超声波辅助法、微波辅助法、酶解法等，其中超声波辅助法是通过超声波在液体媒介中产生的机械振动和空化作用对植物细胞进行破坏， 从而增加细胞内各类物质溶出[7]。 超声波法有着条件温和、处理时间短的优势， 该法适用于原花青素这类热稳定性较差物质[8-9]的辅助提取。

紫外线尤其是波长为290～320 nm 的中波紫外线（UVB）可使人体产生红斑，且到达真皮层致使人体皮肤出现晒伤、晒黑和脱皮等现象[10]。 目前市售防晒化妆品中的防晒成分包括甲氧基肉桂酸乙基己酯、 丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷和二氧化钛等， 这些成分长时间暴露在紫外线下会对人体产生不利影响[11]，因此，植物天然防晒品受到广泛的关注。 本研究以防晒系数为指标对样品抗紫外活性进行评价， 并选用简便快捷的紫外分光光度法[12-14]对样品SPF 进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓籽，烘干至恒重，研磨过60 目筛；原花青素标准品，如吉生物科技公司；香草醛、无水甲醇、无水乙醇、浓盐酸等，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司。

UV-2700 紫外分光光度计，日本岛津仪器有限公司；SK6210HP 超声波清洗器， 上海科导超声仪器有限公司；5804R 冷冻离心机，艾本德仪器有限公司；GT-100 振动球磨仪， 北京格瑞德曼仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原花青素标准曲线的绘制 以原花青素标准品为对照，采用盐酸-香草醛法[15]进行标准曲线的绘制。 将原花青素标准品配制成0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg/mL 甲醇标准溶液。取各质量浓度标准溶液1 mL 加入10 mL 具塞试管中并加入6 mL 的40 mg/mL 香草醛-甲醇溶液，再加入3 mL浓盐酸，混匀后置于30 ℃水浴锅中显色1 h，以甲醇为空白对照，在500 nm 波长处测定吸光度并绘制曲线。 得到回归方程：y=1.7703x-0.0078，R2=0.9997，式中x 为质量浓度，y 为样液在500 nm 波长处吸光度，该曲线在0.10～0.50 mg/mL 质量浓度范围内线性关系良好， 适用于红树莓籽提取液中原花青素质量浓度计算。

1.2.2 红树莓籽原花青素的提取 称取1.00 g 红树莓籽粉于100 mL 锥形瓶中， 按料液比1∶30 g/mL 加入不同体积分数乙醇溶液摇匀。在设定温度下进行超声波处理， 抽滤后将滤液在6 000 r/min下离心10 min 并将上清液定容至50 mL 待测。

1.2.3 红树莓籽原花青素浓度的测定 取1.2.2节中定容后样液1 mL 按1.2.1 节操作显色后测定吸光度， 由回归方程得出样液中原花青素浓度并计算原花青素得率，计算公式：

式中：C——定容后样液质量浓度，mg/mL；V——待测液总体积，mL；d——稀释倍数；M——红树莓籽质量，g。

1.2.4 提取工艺优化 以原花青素得率为指标，通过单因素试验对影响得率的各因素进行考察，筛选出对得率影响较为显著的因素进行响应面优化并确定其水平范围。单因素试验中，超声波功率的考察水平为160，170，180，190，200 W； 超声波处理温度的考察水平为30，40，50，60，70 ℃；乙醇体积分数的考察水平为60%，65%，70%，75%，80%； 超声波处理时间的考察水平为15，20，25，30，35 min。 利用Design-Expert 8.0.6 软件对上述4 个主要影响因素进行Box-Benhnken 响应面试验设计，因素及水平如表1。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Factors and their coded levels used in response surface design

1.2.5 紫外分光光度法测定SPF 准确称取红树莓籽原花青素提取物和市售化妆品Ⅰ、 Ⅱ（标示SPF 分别为35，25）各1.000 g 溶于100 mL 乙醇中， 超声波处理使提取物及化妆品充分溶解，用0.45 μm 滤膜过滤，弃去最初10 mL 滤液，其余滤液作为10 mg/mL 母液。 将红树莓籽原花青素母液分别稀释至0.10，0.20，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，4.00，6.00，8.00 mg/mL 并倒入1 cm 石英比色皿中， 利用紫外分光光度计在290～320 nm 波段内，每隔5 nm 对样液的吸光度进行3 次测定，乙醇做空白对照并计算样液SPF 值[16]。 利用紫外分光光度计测定样液在紫外波段内的吸光度， 依据Mansur[17]的方程对样液SPF 进行计算，计算公式：

式中：CF——校正因子， 值为10；EEλ——波长λ 下辐射出的红斑效应；Iλ——太阳光谱强度；Aλ——λ 波长下的吸光系数。公式（2）中EEλ×Iλ是由Sayre[18]测得的SPF 计算规范系数（表2）各波长所对应系数的总和为1。

表2 SPF 计算规范系数Table 2 Normalized product function used in the calculation of SPF

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声波功率对原花青素得率影响分析 超声波在溶剂中产生的机械振动和空化作用会破坏红树莓籽细胞，从而提高原花青素的溶出量。由图1 可知，随着超声波功率的增加，原花青素的得率不断上升并在180 W 达到峰值； 之后得率开始呈现下降趋势， 因过高的功率会增加液体媒介的机械振动并产生热量， 会破坏原花青素的结构而导致得率下降。因此，确定180 W 为最佳提取功率并设置该功率为响应面优化的零点。

2.1.2 提取温度对原花青素得率的影响分析 由图2 可知，在30～50 ℃范围内随着温度的升高，得率也逐渐增加， 是因温度升高导致分子热运动加剧， 红树莓籽中原花青素与溶剂间作用增强从而溶出量增加；但原花青素属于热敏性物质，所以当温度升至50 ℃时，得率开始呈现降低趋势。 因此，原花青素的适宜提取温度为50 ℃。

2.1.3 乙醇体积分数对原花青素得率的影响分析

乙醇体积分数对原花青素得率的影响如图3 所示。随着乙醇体积分数提高，原花青素得率也逐渐提高，并在乙醇体积分数75%达到峰值；之后原花青素得率开始呈现降低趋势， 可能是由于一些极性与乙醇相近的杂质溶解量增加， 阻碍了原花青素溶出。 因此确定75%为乙醇最佳提取条件并进一步优化。

2.1.4 提取时间对原花青素得率影响分析 由图4 可知，随着超声波处理时间延长，得率迅速上升并在25 min 达到峰值14.32 mg/g； 但得率在25 min 之后开始下降， 可能是由于超声波处理时间过长使得溶质和溶剂间的热效应增强， 使原花青素的结构受到破坏；此外，原花青素自身的酚羟基也会与溶剂中的游离自由基结合而被氧化， 进而导致得率降低。 因此，超声波处理时间不宜过长，选定25 min 为最佳提取时间。

图1 超声波功率对原花青素得率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on the extraction rate of proanthocyanidins

图2 提取温度对原花青素得率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on the extraction rate of proanthocyanidins

图3 乙醇体积分数对原花青素得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins

图4 提取时间对原花青素得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on the extraction rate of proanthocyanidins

2.2 响应面优化设计

2.2.1 Box-Benhnken 设计结果及分析 选取超声波功率（A）、提取温度（B）、乙醇体积分数（C）、提取时间（D）为考察因素，以原花青素得率（Y）为响应值进行Box-Benhnken 响应面优化设计，试验结果如表3。 其中1～24 号试验为析因试验，25～29号试验为零点试验用来估计误差。 通过Design-Expert 8.0.6 软件对表3 试验结果进行回归拟合，所得回归方程为：

Y=14.44+0.055A-0.11B+0.52C+0.25D-0.14AB-0.07AC-0.53AD+0.73BC-0.38BD-0.22CD-1.32A2-0.87B2-1.00C2-0.14D2。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

由表4 方差分析结果可知， 对红树莓籽原花青素提取所建立二次多项式数学模型极显著（P＜0.01）； 模型决定系数R2=0.9915， 失拟项不显著（P=0.997＞0.05）， 校正系数R2adj=0.9829 说明模型能够较好地描述超声波提取红树莓籽原花青素过程中得率随提取条件的变化规律， 可通过该模型对红树莓籽中原花青素的提取结果进行分析和预测。 由F 值可知，4 个因素对响应值的影响程度依次为乙醇体积分数（C）＞提取时间（D）＞提取温度（B）＞超声波功率（A）；由模型中各项P 值可知，交互项中超声波功率和提取温度（AB）、超声波功率和提取时间 （AD）、 提取温度和乙醇体积分数（BC）、提取温度和提取时间（BD）、乙醇体积分数和提取时间（CD）的交互作用对原花青素的得率影响显著。

2.2.2 响应面各因素间交互作用分析 图5 中a～f 是反映各因素交互作用与原花青素得率间关系的响应面3D 图及等高线图。根据响应面所呈现的形状、陡峭程度及其等高线的变化情况，分析超声波功率、提取温度、提取时间、乙醇体积分数间交互作用对原花青素得率的影响。 图a 为超声波功率-提取温度交互作用与得率关系的响应面图，随着提取温度和功率逐渐增加， 原花青素得率呈现先增加后下降的趋势， 且等高线图b 趋于椭圆形，证明交互作用对得率影响较为显著；图c 为乙醇体积分数-提取温度与得率关系的响应面图，图形呈较为陡峭的拱形且等高线图为椭圆形， 说明乙醇体积分数与提取温度的交互作用对得率的影响极为显著； 图e 中提取时间在低水平与高水平所对应的得率差别较小， 但随乙醇体积分数的增加，得率呈现先增加后降低的趋势。 由此可知，超声波辅助提取技术可以有效地在短时间内使原花青素溶出。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for the established regression model

图5 各因素交互作用响应面图Fig.5 Response surface and contour plots

2.2.3 验证试验 根据模型可知预测原花青素最优提取工艺条件为：乙醇体积分数75.35%、提取功率178.30 W、 提取温度47.60 ℃、 提取时间30.00 min。 在此条件下原花青素得率理论值达14.65 mg/g。 为验证预测工艺参数的可行性，考虑实际操作条件， 将最佳工艺调整乙醇体积分数75%、提取功率180 W、提取温度48 ℃、提取时间30 min。 进行3 次平行试验，原花青素得率分别为14.62，14.55，14.57 mg/g， 平均值14.58 mg/g 与预测值接近，证明模型预测最优工艺参数实际可行。

2.3 红树莓籽原花青素抗紫外活性评价

长期紫外线照射会导致皮肤产生老化而导致皮肤肿瘤发病率升高[19]，但目前市售防晒化妆品中主要抗紫外成分多以化学成分为主， 存在一定安全隐患， 因此天然抗紫外成分的开发已经成为化妆品的主要研发方向。 SPF 的测定方法主要包括人体法、无毛小鼠法和体外分光光度法等[20]，由于人体法可能对人体皮肤产生损伤且无毛小鼠法操作繁琐， 因此本文选用体外分光光度法对提取所得红树莓籽原花青素及市售化妆品进行SPF 的测定， 以评价红树莓籽原花青素的抗紫外能力并与市售化妆品进行对比。

利用紫外分光光度计对0.1～10 mg/mL 质量浓度范围内样品及两种市售防晒霜Ⅰ、 Ⅱ进行290～320 nm 波长范围内吸光度的测定，结果如图6 所示。 样品质量浓度低于2 mg/mL 时，样品在各波长处吸光度均随浓度升高而提升； 防晒霜Ⅰ与0.8 mg/mL 样品在各波长吸光度接近， 在310 nm后吸光度略高于0.8 mg/mL 样品， 但310～320 nm波长范围的规范系数较低， 使防晒霜Ⅰ的SPF 低于0.8 mg/mL 样品。质量浓度高于4 mg/mL 的样品在290～320 nm 波长范围内整体吸光度较高，2 mg/mL 样品虽然在305 nm 处吸光度与4 mg/mL 样品接近， 但由于在300 nm 和310 nm 处吸光度明显低于4 mg/mL，同时规范系数中这两处波长的系数常量较高， 导致2 mg/mL 样品的SPF 与4 mg/mL样品有较大差距。

图6 红树莓籽原花青素吸光度分布Fig.6 Absorbance distribution of 0.1-10 mg/mL proanthocyanidins from 290 nm to 320 nm

图7和图8 分别反映了红树莓籽原花青素质量浓度在0.1～1.2 mg/mL 及0.1～10 mg/mL 范围内SPF 的变化情况。 由图7 可知，红树莓籽原花青素质量浓度在0.1～1.2 mg/mL 的范围内，其SPF 随着浓度的增长逐渐上升，且二者呈一定线性关系，y=8.1919x-7.5555，R2=0.9521 说明有较好的相关性。当红树莓籽原花青素质量浓度上升到4 mg/mL时，SPF 逐渐趋于平稳，这可能是由于质量浓度为4 mg/mL 时红树莓籽原花青素溶液对290～320 nm波长范围的紫外线吸收逐渐饱和导致SPF 基本不变。

利用紫外分光光度法对市售防晒霜Ⅰ、 Ⅱ的SPF 进行测定，防晒霜实际SPF 均低于标示SPF，与Fonseca[21]所叙述结果一致。 图9 对比了两种防晒霜与0.8 mg/mL 和10 mg/mL 红树莓籽原花青素的SPF，结果表明，质量浓度均为10 mg/mL 时红树莓籽原花青素SPF 远高于市售防晒霜的SPF；质量浓度为0.8 mg/mL 红树莓籽原花青素提取物SPF 可达24.07，略高于杨健[22]所得葡萄籽原花青素SPF，与市售防晒霜Ⅰ的实际SPF 接近，说明红树莓籽原花青素在防晒化妆品领域有极大的应用前景。

图7 红树莓籽提取物浓度与SPF 的线性关系Fig.7 Linear relationship between SPF and proanthocyanidins concentration （0.1-1.2 mg/mL）

图8 红树莓籽提取物浓度对SPF 的影响Fig.8 Effect of proanthocyanidins concentration on SPF （0.1-10 mg/mL）

图9 红树莓籽提取物与防晒化妆品的SPF 对比Fig.9 Comparison of SPF between proanthocyanidins and sunscreens

3 结论

利用超声波辅助提取法对红树莓籽中原花青素进行提取，并通过Box-Benhnken 设计对提取工艺进行优化，得到了超声功率180 W、提取温度57℃、乙醇体积分数75.5%、提取时间30 min 的最优工艺参数， 在此条件下红树莓籽原花青素得率为14.58 mg/g。

以SPF 为指标， 对所得红树莓籽原花青素进行抗紫外活性研究， 结果表明红树莓籽原花青素质量浓度在0.1～1.2 mg/mL 范围内，其SPF 与浓度成线性正相关，相关系数0.9521；质量浓度为0.8 mg/mL 时SPF 可达24.07，高于市售SPF35 防晒霜的实际SPF； 质量浓度为2 mg/mL 时其SPF 可达42.84， 质量浓度为6 mg/mL 时达到最大值52.90显著高于市售化妆品标示SPF， 说明红树莓籽原花青素具有较强的抗紫外能力。 本研究为红树莓籽加工副产物再利用及红树莓籽提取物在化妆品工业中的应用提供了理论依据。