普兰林肽改善阿尔茨海默病的机制

连勇军 邹良玉 欧艺 赵亚丽

(1深圳市人民医院神经内科，广东 深圳 518020；2深圳市福永人民医院内二科)

研究表明，2型糖尿病患者发展为阿尔茨海默病(AD)的风险显著增加〔1〕，AD患者中包括胰岛素在内的多种代谢激素水平有明显变化，比如皮质醇和瘦素〔2～6〕。用胰岛素或相关的代谢激素恢复脑部胰岛素信号传导可能为AD患者提供益处。胰岛淀粉样多肽能通过血脑屏障，小鼠中胰岛淀粉样多肽的脑摄取量约为胰岛素的3倍，其受体广泛分布在整个中枢神经系统(CNS)中，在大脑最后区，孤束核，臂旁核，杏仁核，下丘脑，伏隔核和背侧切片中有最高密度的胰岛淀粉样多肽结合〔7〕。胰岛淀粉样多肽具有抗焦虑和抗抑郁〔8〕的作用及镇痛特性〔9〕，但是这些作用机制尚未完全了解。在外周组织和CNS中，胰岛淀粉样多肽与胰岛素信号级联相互作用，激活胰岛素的下游靶标，比如信号转导和转录激活因子(STAT)3，腺苷一磷酸(AMP)激活蛋白激酶(AMPK)和蛋白激酶B(Akt)级联，参与细胞代谢和存活〔10〕。除了胰岛素信号通路之外，胰岛淀粉样多肽也是细胞外调节蛋白激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的调节器，这与海马体的突触可塑性和记忆巩固密切相关〔11，12〕。本研究探讨胰岛淀粉样多肽类似物普兰林肽对SAMP8小鼠的记忆效应，通过分析体内外的信号转导变化，验证受体功能，确定与改善认知相关的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 醋酸普兰林肽购自Sigma公司；细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)5，p35/p25蛋白，突触蛋白(Synapsin)Ⅰ，血红素加氧酶(HO)-1，磷酸化(p)-ERK1/2和ERK1/2抗体购自CST公司；二抗购自北京中杉金桥生物有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒及电化学发光液购自上海碧云天生物公司；渗透性泵购自Alzet公司；神经基础培养基(Neurobasal-A)、B27购自美国Gibco公司。

1.2实验动物 6月龄SAMP8小鼠购自广东省医学实验动物中心。集体饲养于SPF级环境中，给予昼夜各12 h的光线变化，正常温控，自由饮水摄食。SAMP8小鼠随机分为普兰林肽组或生理盐水组，每组10只，实验周期共5 w。将Alzet微型渗透压泵手术植入实验小鼠皮下，每天输注0.25 mg/kg醋酸普兰林肽(0.6 mg/ml)或生理盐水，速度为0.5 ml/h。整个实验过程每2 w换1次新的填充泵。所有动物每周称重。

1.3物体识别实验 在5 w实验期的最后1 w，进行物体识别实验，检测动物行为。测试设置包括4个相邻的开放式箱子，间接昏暗照明。在训练前1天，将小鼠单独置于1个箱子中，适应15 min。第2天，在箱子底部一侧相对放入2个相同物体，将小鼠背对物体放入箱子中，允许小鼠探索环境10 min，在此期间，开启录像设备，用跟踪系统记录其运动轨迹。每次试验后，用70%乙醇清洗物体和开放箱子以消除任何嗅觉影响。3 h后进行测试试验。小鼠再次被放置在箱子中，但是，一个类似大小和复杂性的新物体取代了训练期间两个相同物体中的一个。允许小鼠探索环境5 min，然后将其放回笼中。记录训练和测试期间小鼠探索物体的时间，即距离物体2 cm范围内的持续时间。辨别指数计算公式为：(N-F/N+F)，N表示动物探索新物体的时间，F表示动物探索熟悉物体的时间。

1.4Western印迹实验 物体识别实验结束后，处死小鼠，解剖取出大脑组织，分离海马体。在加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中匀浆，离心，取上清，用BCA试剂盒对蛋白定量。在10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中进行分离，将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%牛奶中封闭1 h后，将膜置于稀释的抗体中，在4℃下孵育过夜，随后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1 h，通过电化学发光法显色，分析目的条带光密度值。主要检测Cdk5，p35，p25，Synapsin I，HO-1，p-ERK1/2和总ERK1/2表达量，选用β-actin作为内参蛋白。

1.5免疫组化实验 取12只小鼠随机分成两组：普兰林肽组和生理盐水组，连续给药2 w后处死。 解剖小鼠，取出大脑组织，用4%多聚甲醛固定24 h，然后置于30%蔗糖溶液(4℃)中3 d，切成40 μm的矢状切片，贴片。清洗后，在1%的过氧化氢溶液中孵育1 h，以阻断内源性过氧化物酶的活性，用3%牛血清白蛋白(BSA)+0.5%Triton封闭1 h，加入稀释的人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)抗体和环氧化物酶(COX)-2抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，然后二抗温育2 h。使用亲和素-生物素-过氧化生物酶复合物(ABC)试剂和二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒完成染色，显微镜下观察。

1.6大鼠大脑皮质神经元的原代培养 从孕18 d SD大鼠胚胎中分离出大脑皮质，剪碎，胰蛋白酶消化，并制成单细胞悬液。将神经元细胞接种到6孔板，置于含2%B27的神经基础培养基(Neurobasal-A)中，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养6 d，加入不同浓度的普兰林肽平行处理1 h或3 h，然后将细胞裂解，离心收集上清，并进行蛋白免疫印迹试验。

1.7统计学分析 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1普兰林肽处理改善SAMP8小鼠物体识别的记忆功能 与探索熟悉物体所需时间相比，在探索新颖物体时，普兰林肽组花费更长的时间，而生理盐水组小鼠探索新颖物体和熟悉物体花费的时间没有太大区别。两组辨别指数比较差异有统计学意义〔(0.68±0.02)vs(0.49±0.04),P<0.05〕。

2.2普兰林肽降低SAMP8小鼠海马体中炎症标志物的表达量 与生理盐水组(0.21±0.03)相比，普兰林肽处理组HO-1蛋白表达量显著降低(0.17±0.01,P<0.05)，普兰林肽组小鼠海马体中COX-2表达较生理盐水组显著降低〔(2.9±0.3)vs(5.0±0.3),P<0.05〕;两组小鼠海马体中HNE水平差异无统计学意义〔(2.5±0.4)vs(3.7±0.5),P>0.05〕，见图1，图2 。

图2 两组COX-2和HNE表达(×400)

2.3普兰林肽增加SAMP8小鼠海马体中SynapsinⅠ表达 与生理盐水组(0.86±0.12)比较，普兰林肽组海马体中SynapsinⅠ表达显著增加(1.17±0.15，P<0.01)。见图3。与生理盐水组(0.58±0.08)比较，普兰林肽组Cdk5表达显著增加(0.85±0.11，P<0.01)。生理盐水组与普兰林肽组比较p35(0.23±0.05 vs 0.31±0.04)、p25(0.67±0.07 vs 0.83±0.06)表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图3 Western印迹检测SynapsinⅠ蛋白表达

图4 Western印迹检测Cdk5、p25、p35蛋白表达

2.4普兰林肽增加小鼠大脑皮质原代神经元细胞中Cdk5的表达 不同浓度的普兰林肽孵育细胞1 h和3 h后，显著增加了神经元中Cdk5的表达，且呈剂量依赖性(P<0.05)。普兰林肽作用3 h增加了p-ERK1/2的表达。见表1、图5。

表1 不同浓度普兰林肽对小鼠大脑皮质原代神经元细胞中Cdk5及p-ERK1/2表达的影响

与0 nmol/L比较：1)P<0.05

图5 不同浓度普兰林肽对小鼠大脑皮质原代神经元细胞中Cdk5和p-ERK1/2表达的影响

3 讨 论

在AD患者血浆样本中，低胰岛淀粉样多肽水平与AD存在显著关联〔11〕。本研究结果表明：在物体识别实验中，普兰林肽作用改善了小鼠的认知、学习和记忆过程。遇到熟悉或新奇物体的探究能力，并不是一般的活动变化，是与认知相关的，并且取决于内侧颞叶功能的完整性〔13〕，内侧颞叶是一个受早期和晚期AD影响的区域。所以，这些发现显示普兰林肽可能有益于治疗散发型AD患者。

长期给予普兰林肽能够改善AD的重要病理特征，包括突触损害和氧化应激。在AD的发病机制中，炎症反应和突触损害两种病理过程均存在于SAMP8小鼠的海马组织中。本实验结果表明，在SAMP8小鼠中，普兰林肽处理组显著降低了HO-1的表达。HO-1是一种在氧化应激和炎症反应期间被激活的细胞应激蛋白，在AD患者的大脑皮层和海马体中表达增加，并且在SAMP8小鼠中呈年龄依赖性增加〔14〕。进一步实验显示，普兰林肽降低了海马体中脂质过氧化反应产物HNE的含量，HNE是一种已知的AD大脑中早期大量存在的细胞应激标记物。COX-2在老龄化和AD大脑中逐渐增加的经典炎症标志物，其表达量明显降低。

海马体中SynapsinⅠ是一种位于神经元突触小泡中的蛋白质，其与突触的形成，神经递质释放，学习和记忆密切相关〔15〕。普兰林肽处理的SAMP8小鼠中SynapsinⅠ表达的增加，说明普兰林肽对突触有保护作用或诱导突触发生。Cdk5是一种脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与新皮质发育过程中的树突生长和神经细胞迁移〔16〕，同时在成人大脑的突触可塑性，学习和记忆中也发挥重要作用。在普兰林肽处理的大脑皮质原代神经元细胞中，Cdk5的表达呈剂量依赖型，说明大脑海马体和皮层神经元中Cdk5的强劲增长可能是普兰林肽发挥作用的分子机制。Cdk5与突触小泡循环，神经递质合成，轴突运输，神经元的存活和细胞死亡及海马神经再生密切相关。已有研究表明，Cdk5在突触形成中起重要作用〔17〕，很可能是由于它对SynapsinⅠ的下游效应。 虽然Cdk5被认为具有神经保护作用，但分裂产物p25的积累，导致Cdk5失调，引起Tau蛋白和神经元过度磷酸化〔18〕。

本研究中，普兰林肽对p25或p35的表达并没有显著影响，表明普兰林肽可以选择性地增加Cdk5的表达，而不促进该激酶的失调。下一步的研究需要确定普兰林肽对Tau蛋白磷酸化的影响，并确定Cdk5是否是影响突触可塑性标志物如SynapsinⅠ变化的因素。

综上，胰岛淀粉样类似物普兰林肽能够改善散发型AD小鼠模型的认知缺陷，减少炎症反应和氧化应激标志物，增加海马组织Synapsin的表达，并与Cdk5的表达有密切关系，这为AD的研究和治疗提供新思路、新途径。