丙泊酚对老年雄性大鼠海马生物钟基因及CRF1R表达的影响

云燕 吴江 高志勇

(1成都三六三医院麻醉科，四川 成都 610000；2西藏自治区驻成都办事处医院)

认知功能障碍(POCD)是手术后常见的并发症，是指患者手术后引起的神经功能、认知功能等发生不同程度的变化，临床表现为术后性格变化、学习能力、记忆下降，严重者甚至会出现认知功能异常及痴呆等，影响患者术后恢复〔1〕。文献报道〔2〕，POCD多发生在老年患者手术后，且临床对其发病机制尚不完全知晓，多与患者年龄有关。丙泊酚是手术中常用的麻醉药物，临床以静脉给药为主，具有麻醉效果好、药物起效快、无蓄积等特点。但最新研究表明〔3〕，丙泊酚的使用会增加POCD发生率，但其机制尚未知晓。研究表明〔4〕，丙泊酚临床使用时能抑制或增强神经受体产生的刺激，能激活甘氨酸受体，抑制谷氨酸兴奋传导，且上述信号通路均与人体记忆能力和学习有关。

海马区是人体相对重要的区域，与学习记忆功能等存在紧密联系〔5〕。从广义角度来说，学习是一个多因素过程，是对新生事物、信息获取和利用的过程，而记忆则是将获得的信息进行存储和保存的过程，海马突触能塑形长时程增强效应与长时程抑制效应，均为学习、记忆的基础〔6〕。学习记忆功能的表达则是通过神经元之间的突触实现信息的沟通、传递和交流。文献报道〔7〕，促肾上腺素皮质激素释放因子(CRF)在认知功能障碍的发生、发展中发挥了关键作用。CRF是促激素释放因子(RF)中的一种，主要由中枢神经系统下丘脑室旁核分泌，当机体处于应激状态时，CFR能诱导促肾上腺皮质激素(ACTH)、β-内啡肽等因子从垂体前叶释放，直接作用于腺垂体促肾上腺皮激素分泌细胞，能促进ACTH分泌〔8～10〕。而杏仁核是下丘脑外主要表达CRF的重要部位，包括CRF1和CRF2两种受体。本文拟探讨丙泊酚对老年雄性大鼠海马生物钟基因及CRF1R表达的影响及机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 取2015年3月至2017年5月进行实验的老年雄性SD大鼠60只，随机数字法分为空白对照组、小剂量丙泊酚组和大剂量丙泊酚组各20只。体重510～590 g，平均(575.8±10.2)g，大鼠均由医院动物实验中心提供。实验过程中对老年SD大鼠的饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导下意见》相关规则，饲养温度(22±2)℃，湿度(55±5)%，饲养时避免强光、噪音等刺激，日照12 h。所有试验通过医院动物委员会批准同意。

1.2主要仪器和试剂 丙泊酚注射液(江苏恩华药业股份有限公司，国药准字H20123138)，Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司)，PM-8000 多参数监护仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，手术器械：医院提供，超低温冰箱(中国雪柜实业有限公司)，荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)，离心机(Eppendorf，德国)，事件相关电位测试剂(上海欣软信息科技有限公司)。

1.3药物使用 3组大鼠均在实验前进行5 d的适应性饲养，并且在实验开始前进行Morris水迷宫实验，将由于视力因素或无法形成记忆的大鼠剔除。小剂量丙泊酚组：给予30 mg/kg丙泊酚腹腔注射，待翻正反射消失后给予25 mg/kg丙泊酚进行维持麻醉。大剂量丙泊酚组：给予50 mg/kg丙泊酚腹腔注射，待翻正反射消失后给予25 mg/kg丙泊酚进行维持麻醉。空白对照组：给予30 mg/kg剂量的乳剂。3组药物注射过程中密切观察大鼠的血氧、保证大鼠无法体动，麻醉后待大鼠自然苏醒〔11〕。

1.4Morris水迷宫试验 (1)原理。Morris水迷宫试验主要由直径150 cm、高50 cm圆形水池与一个能调节高度、能移动位置平台构成，且水池壁上具有4个等距离的入水电，将水池分为4个象限，并将平台放置在第三象限。水池内放置数码相机、监视采集卡、计算机等，对大鼠试验中的游泳轨迹等数据进行记录，待大鼠爬到平台后计算机完成追踪，经过相关软件计算大鼠游泳的路径长度、找到平台所需时间、游泳速度〔12〕。(2)实验方法。训练前大鼠适应性训练2 min，Morris水迷宫试验训练5 d，每天早晨8∶00训练，每天4次。大鼠在120 s内找到平台，允许其在平台上进行30 s；在120 s内未找到平台，潜伏期记录为120 s，人为帮助找到平台，允许大鼠休息30 s，休息结束后进行下一次实验〔13，14〕。

1.5观察指标 (1)认知功能。采用事件相关电位测试剂及眼动测定3组药物干预前后认知功能情况，检查时按摩大鼠四肢，尽可能让其保持全身肌肉放松，认真记录电位P300潜伏期、波幅、凝视点数(NEF)及反应性探索评分(RSS)〔15〕。(2)Morris水迷宫试验。检测3组药物使用前后Morris水迷宫试验下游泳的路径长度、找到平台所需时间、游泳速度。(3)海马生物钟基因测定。3组完成Morris水迷宫试验后0、1、6、24 h，每组取大鼠4只断颈处死取出全脑放置冰上，充分暴露脑部组织，沿着脑中断完成皮质剥离，将海马组织迅速分离，利用实时定量聚合酶链反应完成海马生物钟基因测定〔16，17〕。(4)CRF1R相对表达量。取海马组织方法同(3)，利用荧光定量聚合酶链反应技术测定海马区域CRF1R相对表达量，有关操作严格遵循试剂盒、仪器步骤完成〔18，19〕。

1.6统计学分析 采用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.13组治疗前后认知功能水平比较 3组药物干预前电位P300潜伏期和波幅及眼动测定水平差异无统计学意义(P>0.05)；空白对照组干预前后差异无统计学意义(P>0.05)；大剂量丙泊酚组干预后电位P300潜伏期显著高于小剂量丙泊酚组和空白对照组(P<0.05)，电位P300波幅及眼动NEF、RSS显著低于小剂量丙泊酚组和空白对照组(P<0.05)，见表1。

组别时间潜伏期(ms)波幅(mV)眼动测定NEF(个)RSS(分)小剂量丙泊酚组干预前314.55±9.214.05±1.7627.30±1.416.15±0.98干预后331.60±25.871)3)3.87±2.661)3)26.30±4.151)3)5.25±1.881)3)大剂量丙泊酚组干预前315.32±9.324.04±1.7327.94±1.236.14±0.95干预后350.21±23.331)2)3)2.58±2.301)2)3)23.10±2.931)2)3)4.10±1.201)2)3)空白对照组干预前315.01±9.324.06±1.7727.29±1.406.13±0.94干预后312.31±9.304.01±1.5926.96±1.326.00±0.91

与空白对照组比较：1)P<0.05；与小剂量丙泊酚组比较：2)P<0.05；与干预前比较：3)P<0.05；同下表

2.23组干预前后Morris水迷宫试验结果比较 3组干预前Morris水迷宫试验游泳路径、找到平台时间、游泳速度差异无统计学意义(P>0.05)；大剂量丙泊酚组干预后游泳路径长度显著长于小剂量丙泊酚组和空白对照组(P<0.05)，游泳速度显著小于小剂量丙泊酚组和空白对照组(P<0.05)；小剂量丙泊酚组干预后游泳路径长度、找到平台时间显著长于空白对照组(P<0.05)，游泳速度显著小于空白对照组(P<0.05)，见表2。

组别时间游泳路径长度(cm)找到平台时间(s)游泳速度(cm/s)小剂量丙泊酚组干预前58.46±4.3620.89±5.350.43±0.12干预后70.93±4.811)3)24.53±5.433)0.39±0.111)3)大剂量丙泊酚组干预前59.06±4.4120.91±5.380.44±0.13干预后87.86±6.941)2)3)30.92±5.891)2)3)0.26±0.081)2)3)空白对照组干预前57.15±4.3321.04±5.410.42±0.11干预后58.75±4.4624.93±5.540.44±0.13

2.33组迷宫试验后不同时间点海马生物钟基因比较 小剂量丙泊酚组与大剂量丙泊酚组0 h海马生物钟基因水平差异无统计学意义(P>0.05)，但显著低于空白对照组(P<0.05)；大剂量丙泊酚组干预后1、6、24 h海马生物钟基因水平显著低于小剂量丙泊酚组和空白对照组(P<0.05)，小剂量丙泊酚组显著低于空白对照组(P<0.05)，见表3。

2.43组迷宫试验后不同时间点CRF1R相对表达量比较 小剂量丙泊酚组与大剂量丙泊酚组0 h CRF1R相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，但显著低于空白对照组(P<0.05)；大剂量丙泊酚组干预后1、6、24 h CRF1R相对表达量显著低于小剂量丙泊酚组和空白对照组(P<0.05)，小剂量丙泊酚组显著低于空白对照组(P<0.05)，见表4。

组别0 h1 h6 h24 h小剂量丙泊酚组0.54±0.251)0.76±0.291)0.89±0.311)0.94±0.351)大剂量丙泊酚组0.55±0.261)0.63±0.281)2)0.71±0.301)2)0.78±0.341)2)空白对照组1.03±0.451.03±0.411.02±0.401.03±0.43

组别0 h1 h6 h24 h小剂量丙泊酚组0.34±0.081)0.38±0.091)0.43±0.091)0.48±0.101)大剂量丙泊酚组0.33±0.091)0.34±0.091)2)0.38±0.091)2)0.42±0.101)2)空白对照组0.53±0.110.52±0.100.50±0.090.54±0.12

3 讨 论

POCD是临床上常见的疾病，多发生于手术后老年人群中，由于老年患者年龄较大，对于手术耐受性较差，再加上其本身伴有不同程度的POCD，导致术后学习记忆力、定向力、社交能力等发生变化，影响患者术后恢复，延长住院时间〔20〕。目前，临床上对于POCD发病机制尚不完全明确，多与年龄、手术类型、麻醉方式等有关，且患者发病后如果得不到及时有效的治疗，将会演变为永久性痴呆〔21〕。

丙泊酚是临床上常用的短效静脉麻醉药物，多以静脉输注给药〔22〕。研究表明〔23〕，丙泊酚在临床使用时容易产生低温、低血压、低氧等并发症，从而容易增加POCD发生率。本研究结果提示，丙泊酚会引起大鼠出现不同程度的POCD，且药物浓度越高，越严重。Morris水迷宫试验主要包括定位航行实验与空间探索实验，定位航行实验能直接反映大鼠的学习能力；空间探索实验可以反映大鼠的记忆能力。学习记忆是人体的高级中枢神经功能，且学习过程中涉及许多神经元及神经元之间信息的交流〔24,25〕。研究表明〔26〕，神经递质、蛋白质等物质表达水平与学习、记忆存在紧密联系，而生物钟基因约占10.0%的基因表达，能控制机体睡眠、学习记忆、内分泌代谢等多种作用。本研究结果提示，丙泊酚对大鼠海马生物钟基因表达水平产生明显影响，且随着药物剂量的增加，其表达水平下降越明显。

CRF主要由41个氨基酸组成，其表达水平能直接参与机体各系统对刺激产生的反应，且能调节机体内脏活动及情绪反应。CRF1R属于G蛋白耦联受体，其N端位于膜外，表达水平与大脑皮质、下丘脑、杏仁核等感觉结构有关〔27,28〕。本研究结果提示，丙泊酚对大鼠CRF1R水平会产生明显影响，但随着药物给药时间的延长，CRF1R水平出现上升趋势，影响相对较轻，能参与机体疼痛、焦虑情绪的调控。由于本课题研究时间较短，纳入动物数量相对较少，丙泊酚对老年雄性大鼠海马生物钟基因的影响及对CRF1R表达影响的机制均需要进一步研究和探讨〔29,30〕。

综上，丙泊酚会对老年雄性大鼠认知功能产生不同程度的影响且呈浓度依赖性，能影响海马生物钟基因及CRF1R表达水平，临床应用时应采取干预措施，减少对认知功能的影响。