PPARγ介导薯蓣皂苷元对人胶质瘤U87MG细胞增殖和凋亡的影响*

张铁山， 尚曙玉， 王聪颖

(黄河科技学院 1生理药理教研室， 2化学教研室， 河南 郑州 450063)

胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤，占到颅内恶性肿瘤的70%以上[1]。目前胶质瘤的标准治疗一般包括最大安全手术切除、放疗和化疗。尽管合理的治疗方案可在一定程度上改善患者预后，但因复发转移率较高，患者的平均生存期只有15～18个月，5年生存率仅为5%[2-4]。因此，寻找新的治疗靶点成为目前胶质瘤研究的热点之一。研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌和胶质瘤等多种肿瘤组织中呈高表达[5-8]，但在人脑组织中却呈低表达[9]，而上调PPARγ蛋白表达可诱导人脑胶质瘤细胞发生细胞周期阻滞和凋亡[10]。这表明PPARγ在胶质瘤中发挥着抑癌作用。研究证实，薯蓣皂苷元(diosgenin, Dio)可上调脂肪细胞中PPARγ蛋白表达水平[11]，这提示Dio可能作为PPARγ激活剂发挥抗胶质瘤作用，但目前国内外尚未见Dio对人胶质瘤作用的报道。因此，本研究拟通过分子生物学方法探究Dio对人胶质瘤U87MG细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。

材 料 和 方 法

1 材料

正常人星形胶质细胞(human astrocytes, HA)购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；人胶质瘤U87MG细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。星形胶质细胞生长培养液(astrocyte growth medium, AGM)套装购自Lonza；RPMI-1640培养液和胎牛血清购自HyClone；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司；薯蓣皂苷元(纯度≥98%)购自中国食品药品检定研究院；PPARγ抑制剂GW9662购自Sigma；Giemsa染色液购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶双染凋亡检测试剂盒和细胞周期试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；ECL化学发光试剂盒和RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人PPARγ、Bcl-2、Bax、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E1和β-actin抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Abcam。

2 方法

2.1细胞培养 HA细胞用含3%胎牛血清、1%左旋谷氨酰胺、0.25%胰岛素、0.1%抗坏血酸、0.1%庆大霉素和0.1%血管内皮生长因子的AGM培养液，U87MG细胞用含10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液，在37 ℃、5% CO2条件下进行培养；当细胞覆盖率达到80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例传代。

2.2药物配制 将Dio和GW9662分别溶于DMSO制成50 mmol/L储备液，分装后于-20 ℃储存。使用时用细胞培养液将储备液稀释至所需浓度，其中DMSO终浓度为0.1%，对照组使用含有0.1% DMSO的细胞培养液。

2.3CCK-8法检测细胞活性 取对数生长期HA细胞和U87MG细胞，以每孔5 000个接种于96孔板，常规培养24 h后去上清，实验孔分别加入100 μL含有不同剂量(10、 20、 30、 40和50 μmol/L)Dio的细胞培养液，同时设调零孔和对照孔，每组设5个复孔；处理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长吸光度(A)值，计算细胞活力。细胞活力(%)=(加药组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%。采用SPSS 16.0软件Probit回归模型计算Dio对U87MG细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。实验重复3次。

2.4RT-PCR检测PPARγ的mRNA水平 将对数生长期U87MG细胞以每孔5×105个接种于6孔板，常规培养24 h后去上清，分别加入不同剂量(0, 20和40 μmol/L)Dio或Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)；处理48 h后，用TRIzol试剂提取总RNA，取2 μg总RNA进行反转录反应，反转录条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。取2 μL上述反应液进行PCR，反应条件：94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环。PPARγ(208 bp)上游引物序列为5’-TTGCAGTGGGGATGTCTCAT-3’，下游引物序列为5’-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3’；GAPDH(217 bp)上游引物序列为5’-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3’，下游引物序列为5’-ATCCACAGTCTTCTGGGTGG-3’。取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，用ImageJ 1.45s软件进行灰度分析，以目的产物与内参照GAPDH的灰度值比值表示目的基因mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

2.5平板集落形成实验 取对数生长期的U87MG细胞，以每孔200个细胞接种于6孔板，细胞分组同2.4；处理48 h后，去上清，加入常规细胞培养液继续培养；10 d后待细胞长成集落，弃上清，PBS洗涤1次，甲醇固定10 min，PBS洗涤1次，Giemsa染色30 min，PBS洗涤2次；在光学显微镜下计数大于50个细胞的集落数，计算集落形成率。集落形成率(%)=集落数/接种细胞数×100%。

2.6流式细胞术检测细胞周期 细胞处理同2.4；收集各组细胞，每组取104个细胞，PBS洗涤2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4 ℃固定24 h；PBS洗涤2次，加入碘化丙啶染色液，4 ℃避光染色30 min；使用流式细胞仪检测细胞周期分布。实验重复3次。

2.7流式细胞术检测细胞凋亡 细胞处理组同2.4；收集各组细胞，每组取104个细胞，PBS洗涤2次，重悬细胞于400 μL Annexin V-FITC结合液中；加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃避光孵育15 min；加入10 μL碘化丙啶染色液，4 ℃避光孵育15 min；使用流式细胞仪分析检测细胞凋亡率。实验重复3次。

2.8Western blot检测蛋白水平 细胞处理同2.4；用RIPA裂解各组细胞提取总蛋白，用紫外分光光度法测定蛋白质浓度；取25 μg蛋白样品进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Ⅰ抗(PPARγ、Bcl-2、Bax、cyclin D1、cyclin E1和β-actin抗体均以1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗(1∶2 000稀释)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL进行发光反应，暗室X胶片显影，拍照，使用ImageJ 1.45s软件进行灰度分析。以目标蛋白与内参照β-actin灰度值的灰度比值作为目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0分析数据。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法进行组间两两比较。以P<0.05时认为差异具有统计学意义。

结 果

1 Dio对HA和U87MG细胞活力的影响

CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，不同剂量Dio组U87MG细胞活力均显著下降(P<0.05)，且随着Dio剂量的增加，细胞活力有逐渐下降的趋势;Dio作用U87MG细胞48 h的IC50为24.31 μmol/L。但不同剂量Dio组HA的活力与对照组的差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

2 Dio对PPARγ mRNA表达水平的影响

RT-PCR结果显示，与对照组比较，20和40 μmol/L Dio组PPARγ的mRNA表达水平显著升高(P< 0.05)，且随着Dio浓度的增加而升高；与40 μmol/L Dio组比较，Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)组PPARγ的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),见图2。

Figure 1.Effect of Dio on the viability of HA and U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L Dio group;#P<0.05vs10 μmol/L Dio group;△P<0.05vs20 μmol/L Dio group;▲P<0.05vs30 μmol/L Dio group.

图1 Dio对HA和U87MG细胞活力的影响

Figure 2.Effect of Dio on mRNA level of PPARγ in U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.

图2 Dio对PPARγ mRNA表达水平的影响

3 Dio对U87MG细胞集落形成的影响

平板集落形成实验结果显示，与对照组相比，20和40 μmol/L Dio组细胞集落形成率显著降低(P<0.05)，且随着Dio浓度的增加而降低；与40 μmol/L Dio组比较，Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)组细胞集落形成率显著升高(P<0.05),见图3。

Figure 3.Effect of Dio on colony formation of U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.

图3 Dio对U87MG细胞集落形成的影响

4 Dio对U87MG细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，与对照组相比，20和40 μmol/L Dio组G0/G1期细胞比例逐渐升高(P<0.05)，S期细胞比例则逐渐降低(P<0.05)；与40 μmol/L Dio组比较，Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)组G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.05)，S期细胞比例则显著回升(P<0.05)，见图4。

Figure 4.Effect of Dio on cell cycle of U87MG cells. Mean±SD,n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.

图4 Dio对U87MG细胞周期的影响

5 Dio对U87MG细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，与对照组相比，20和40 μmol/L Dio组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，且随着Dio浓度的增加而上升；与40 μmol/L Dio组比较，Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)组细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，见图5。

6 Dio对相关蛋白表达水平的影响

Western blot结果显示，与对照组相比，20和40 μmol/L Dio组Bcl-2、cyclin D1和cyclin E1蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)，PPARγ和Bax蛋白表达水平则逐渐升高(P<0.05)；与40 μmol/L Dio组比较，Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)组Bcl-2、cyclin D1和cyclin E1蛋白表达水平显著回升(P<0.05)，PPARγ和Bax蛋白表达水平则显著降低(P<0.05)，见图6。

讨 论

Dio是从薯蓣科植物的根茎中提取出来的一种甾体化合物，具有降血脂、抗血小板聚集和抗炎等药理作用[12-14]。近年来，Dio的抗肿瘤活性备受关注。多项研究证实，Dio可通过抑制肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、阻碍肿瘤细胞迁移和侵袭等发挥抗肿瘤活性[15-19]。本研究表明，Dio可剂量依赖性地抑制人脑胶质瘤U87MG细胞活力，但对人正常星形胶质细胞活力无显著影响，提示Dio具有良好的抗胶质瘤作用。

Figure 5.Effect of Dio on apoptosis of U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.

图5 Dio对U87MG细胞凋亡的影响

Figure 6.Effect of Dio on expression levels of related proteins. Mean ±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.

图6 Dio对相关蛋白表达水平的影响

PPARγ是一种由配体激活的核转录因子，属于II型核受体超家族成员，在肿瘤的发生、生长、转移以及肿瘤血管生成等方面发挥重要作用，是肿瘤防治的一个新靶标[20]。研究表明，上调PPARγ蛋白表达可抑制人肝癌细胞迁移和侵袭，并诱导其凋亡[21]， PPARγ 可通过下调cyclin D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)、CDK6和Bcl-2蛋白表达以及上调Bax蛋白表达而抑制人胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡[10]。本研究显示，Dio可剂量依赖性地上调U87MG细胞中PPARγ的mRNA和蛋白表达水平，抑制细胞增殖，诱导G0/G1期阻滞和凋亡，但该作用可被PPARγ抑制剂GW9662阻断，这表明PPARγ在胶质瘤中充当着抑癌基因的作用，并介导了Dio对U87MG细胞的抑制作用。

Cyclin是细胞周期调控的关键因子。Cyclin D1和cyclin E1均为细胞周期G1期的关键蛋白，调控细胞由G1期向S期转换[22]。Srinivasan等[23]研究显示，Dio可下调cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达使乳腺癌细胞阻滞于G0/G1期。Cyclin D1和cyclin E1表达下降会导致U87MG细胞细胞发生G0/G1期阻滞[24-25]。本研究显示，Dio可剂量依赖地下调cyclin D1和cyclin E1蛋白表达水平，且该作用可被GW9662抑制，这表明Dio可通过PPARγ抑制cyclin D1和cyclin E1蛋白表达，阻滞U87MG细胞于G0/G1期。

Bcl-2家族蛋白在调控细胞凋亡中发挥着关键性作用，其中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是该家族的重要成员[24-25]。Bcl-2蛋白表达水平下降和Bax蛋白表达水平升高会促进U87MG细胞凋亡[26]。Das等[27]研究证实，Dio可通过上调Bax蛋白水平和下调Bcl-2蛋白水平促进人皮肤鳞癌A431细胞凋亡。本研究显示，Dio可剂量依赖性地下调Bcl-2蛋白表达水平和上调Bax表达蛋白水平，该作用也同样可被GW9662抑制，这表明Dio可引起Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达失衡，导致U87MG细胞凋亡，而PPARγ介导了该效应。

由于体外实验的局限性，本研究尚存在一定的不足之处。但已有研究证实，Dio在动物体内仍具有显著的抗肿瘤作用。Das等[27]通过皮内注射小鼠恶性肉瘤S-180细胞建立小鼠移植瘤模型，经尾静脉给予Dio(20 mg·kg-1·d-1)，第18天结果显示肿瘤移植瘤的生长受到显著抑制。Dong等[28]向C57BL/6雌鼠皮下注射小鼠黑色素瘤B16F10细胞建立小鼠移植瘤模型，每天以20 mg/kg Dio灌胃，2周后结果显示，移植瘤的生长也受到显著抑制，移植瘤组织中TUNEL阳性细胞数显著升高。

综上所述，Dio可在体外抑制U87MG细胞增殖并诱导其凋亡，这可能与Dio上调PPARγ表达，继而抑制cyclin D1、cyclin E1和Bcl-2蛋白表达以及上调Bax蛋白水平有关。本研究为Dio用于治疗胶质瘤提供了参考资料。