电针对颅脑损伤大鼠海马CA1区细胞凋亡的影响*

陈坤黄寓，王 东，杨 欢，王 鑫，折雪妮，王瑞辉

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000)

颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是外科常见的且危及生命的疾患之一，不仅会带来身体上的残疾，对大脑学习认知能力亦会产生负面效应，目前，电针对脑损伤的治疗作用已取得肯定的疗效[1-2]，但对其机制的研究尚未明确。本实验采用Morris水迷宫测试、HE染色及Western印记分析等测定方法，观察大鼠颅脑损伤前后行为学及凋亡蛋白caspase-3的变化及电针对其影响，以探讨电针对脑损伤大鼠海马区的影响机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用SD大鼠60只，体质量210～240 g，由成都达硕试验动物有限公司提供，合格证号SCXK(川)2015-030，自由饮食，(20±3)℃下饲养，造模前禁食12 h，禁水2 h。

1.2 模型制备及分组

使用改良的Feeny自由落体损伤装置建立颅脑损伤模型[3]。大鼠被随机分为：①假手术组20只，沿头顶正中线切开头皮，在左侧颅骨钻孔后缝合头皮，不作打击；②模型组20只，使用改良的Feeny自由落体装置打击左侧大脑，深度约5 mm,后缝合头皮；③电针组20只，在造模24 h后开始针刺治疗。14天后各组分别取材。

1.3 电针处理

在颅脑损伤后第2天，参照《实验针灸学》[4]动物实验定位取穴，电针大鼠“百会”“大椎”“内关”“足三里”穴。用动物固定架固定大鼠，沿皮下缓慢进针，深度5 mm，接通电针仪，正负极连接前肢与后肢针尾。电针仪用华佗牌SDZ-IIA, 频率为5～10次/s,疏密波形，强度以大鼠轻微颤抖为度[5]，时间15 min，1次/天，共14天，治疗7次后间隔1天继续电针治疗。

1.4 Morris水迷宫

在造模后第11天，对大鼠进行为期5天的学习训练。在圆筒形水池装满水，分为4个象限，将平台放置于某个象限，让大鼠沿池壁下水，摄像机记录60 s内大鼠登上平台所需时间(逃避潜伏期)。每只大鼠每天从4个象限分别进行1次学习训练，若90 s内未能登上平台，则将大鼠引导至平台以强化记忆15 s。取后3天大鼠逃避潜伏期的均数为大鼠的学习记忆成绩。在第5天训练结束后，撤离平台，记录大鼠60 s内穿越原平台的次数。

1.5 组织灌注和取材

在对大鼠进行学习记忆能力测试结束后，对实验大鼠进行取材。每组抽取10只大鼠取新鲜左脑海马组织，剩余10只大鼠的大脑用石蜡固定用于组织切片。将大鼠麻醉后(10%水合氯醛3.5 mL/kg)固定于动物台，打开胸腔后用灌注针头插入大鼠心尖开始灌注生理盐水，直至大鼠肺脏、肝脏等组织呈白色失血样。随后断头打开颅腔，用直镊小心拨开大脑皮质，分离左侧海马，迅速置于-80℃冰箱中保存。用于石蜡切片的脑组织，将海马剥离后冠状面切块置于4%的多聚甲醛溶液中固定，24 h内脱水包埋后石蜡切片5 μm备用。

1.6 Western-blot

将海马称重，根据1 mg组织加入6 μL裂解液(含1 mM PMSF)，进行组织匀浆，离心机转速10 000 r/min离心5 min,提取上清液；按照BCA蛋白浓度试剂盒说明书调整至蛋白浓度一致；制备SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶(12%分离胶+5%浓缩胶)，电泳分离蛋白；湿法转移到PVDF膜上；用5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h,加入兔抗大鼠caspase-3(1∶1 000)，4℃孵育过夜；室温复温1 h，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(1∶500)，室温孵育1 h;洗膜后用超敏ECL化学发光试剂盒进行发光显色，拍照记录。

1.7 HE染色

染色前将石蜡切片在65℃烤箱中烤片1 h，于二甲苯、梯度酒精(100%、95%、90%、80%、75%)中脱蜡，纯水冲洗1 min,苏木素先用滤纸滤过杂质，再将切片浸入5 min，纯水冲洗1 min,伊红染色1 min,纯水冲洗清除残留染色液，镜下观察染色情况。染色成功后，分别在80%、95%、100%无水乙醇中浸泡数秒，二甲苯中脱水5 min,中性树胶封片。光学显微镜下拍摄切片海马CA1区，观察该区神经元细胞的损伤程度和形态变化。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠学习记忆能力、空间探索能力比较

相较于第1天，第2天各组的逃避潜伏期均有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；在第3～5天期间，模型组的逃避潜伏期明显较假手术组更长(P<0.01)，电针组逃避潜伏期时间明显较模型组更短(P<0.01)；在水迷宫实验第5天，模型组穿越平台次数明显少于假手术组(P<0.01)，而电针组穿越平台次数则多于模型组(P<0.05)。见表1。

组别n逃避潜伏期(s)穿越平台次数(次)第1天第2天第3天第4天第5天假手术组2053.7±12.248.4±11.426.4±10.4▲▲17.3±8.4▲▲16.3±4.3▲▲4.7±1.0▲▲模型组2057.6±10.451.2±8.049.4±9.344.2±8.733.6±7.80.7±0.2电针组2056.4±9.249.3±9.831.6±6.9▲▲25.1±7.1▲▲24.6±6.4▲▲2.8±0.6▲

注：与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

2.2 Western blot法检测海马CA1区caspase-3的表达量比较

模型组的caspase-3蛋白表达量明显高于假手术组，且比电针组表达明显。见图1。

注:A.假手术组；B.模型组；C.电针组。图1 各组大鼠海马CA1区caspase-3蛋白的表达水平

2.3 各组海马病理学检查结果比较

假手术组观察到海马CA1区无细胞及组织结构改变，神经元形态、结构正常，核椭圆蓝染，胞质粉红;模型组海马CA1区组织间质水肿，神经元细胞排列松散，神经细胞萎缩，核固缩严重，空泡较多；电针组脑组织恢复程度明显，水肿几乎消失，细胞层次清晰，损伤组织周围可见完好细胞结构，核固缩现象减少,空泡减少。见封三彩图2。

3 讨论

创伤性颅脑损伤(TBI)常常发生突然，预后不佳。海马结构属于脑的边缘系统中的重要结构，与学习、记忆、认知功能有关[6]。海马组织尤其是CA1区对缺氧等损伤最为敏感，也被称为易损区[7]。TBI发生后其神经破坏和神经功能恢复的过程可概括为:①原发性损伤对脑组织的破坏；②TBI后损伤部位及其周围的神经细胞继续发生坏死或凋亡，继而产生继发脑损伤(Secondary brain injury,SBI);③TBI后神经元的自我修复与再生[8]。细胞凋亡是重要的神经细胞死亡方式，是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)级联反应事件的结果[9]。在线粒体介导的细胞凋亡中，caspase-3位于该反应的下游，与其他下游的caspase成员一起执行凋亡事件[10-11]。本实验通过观察caspase-3在脑损伤大鼠海马CA1区表达量的变化以及细胞病理学改变，揭示电针对颅脑损伤大鼠神经细胞凋亡的影响机制，即通过下调caspase-3的表达来抑制细胞凋亡，促进神经元的恢复与再生。

颅脑损伤在中医里属“脑伤”“跌仆”，病位在脑，病机为血瘀、气滞导致清窍闭阻或气机逆乱，《诸病源候论》说：“夫有瘀血者，令人喜忘”，故治疗应活血化瘀、疏通经络、调理气机[12]。本研究穴选督脉加手足阳明经穴，《难经》曰:“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑”，且督脉与手足三阳经及阳维脉交会，总督一身阳气，统帅整体经脉[13]。百会穴属督脉通于脑，醒神益智、升清降浊。大椎穴能调节脏腑功能，健脑益髓。颅脑外伤后对学习记忆能力有所影响，《黄帝明堂经》中就有内关主“失智”，能“醒脑神”的记载[14]。足三里为阳明经穴，补益气血，为治疗下肢痿痹的要穴。电针上述穴位，给予颅脑损伤大鼠连续电生理刺激，以养血祛瘀、醒神健脑。

本研究从颅脑损伤后电针对大鼠的认知功能和海马CA1区凋亡蛋白caspase-3的表达量的影响，探索了电针对于脑损伤治疗的作用机制，即通过抑制凋亡蛋白caspase-3 的表达抑制细胞凋亡线粒体途径的级联反应，减少细胞凋亡，从而恢复认知功能。