低氧运动对营养性肥胖大鼠骨骼肌AMPK-PGC-1α的影响

吴菊花 钟红梅 杨亚南 赵芳芳 徐国琴 翁锡全 林文弢，

1 广西科技大学体育学院（柳州545006）

2 广西科技大学鹿山学院 3 广东省足球运动中心

4 吉林大学珠海学院 5广州体育学院

肥胖已成为现今社会较常见的一种营养代谢性疾病，其患病人群逐渐增加，并可能伴随多种并发症，例如冠心病、代谢综合症、抑郁等[1，2]。一般而言，低热量饮食摄入加上规律性运动是肥胖者最常见的减肥方式，然而运动也可能引起食欲增强。许多研究表明，与居住平原地区相比，生活在高海拔地区的人体内脂肪比例更低。因此，低氧疗法（包括低氧暴露或低氧运动训练）逐渐被推荐为一种治疗和预防肥胖的方法，可通过抑制食欲，增加基础代谢率和脂肪氧化，并尽量减少副作用。已有研究表明低氧环境可有效控制体重，降低血脂[3，4]，冯连世等的研究显示了低氧环境下进行耐力运动，可显著降低肥胖青少年的体重及体脂[5]。此外，还有学者发现低氧环境因素可有效增强运动提高能量消耗的作用效果[6]。可见，无论低氧暴露或低氧结合耐力运动，均可改善机体肥胖程度，影响机体能量代谢，而低氧与运动结合对减肥的作用效果可能更佳。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是骨骼肌的能量感受器[7]，研究发现低氧或运动均可促进AMPK表达上调[8，9]。在线粒体生物发生信号通路或骨骼肌脂肪酸氧化代谢中，PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha）起重要作用，研究表明有氧耐力运动可上调骨骼肌中PGC-1α的表达[10]。AMPK 作为PGC-1α的重要调节因子，可活化PGC-1α，增强骨骼肌线粒体生物合成，并促进脂肪酸氧化[11]。目前，学者们的研究多着眼于常氧状态下运动对机体AMPK-PGC-1α的影响，而低氧结合有氧耐力运动对大鼠骨骼肌AMPKPGC-1α的影响作用未见相关报道。鉴于此，本研究观察低氧运动干预对肥胖大鼠骨骼肌AMPK、PGC-1α蛋白表达的影响，进而探讨低氧运动影响骨骼肌脂肪酸氧化代谢的机理，为低氧运动应用于肥胖人群减控体重提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验器材

Western blotting 所用抗体：抗PGC-1α（ab54481，ABCAM 公司），抗AMPKα（2532s ，cell signaling 公司），抗PhosphoPlus® AMPKα（Thr172）（2531s ，cell signaling 公司），抗GAPDH（ab8245，ABCAM 公司），抗HRG-rabbit（7074s，cell signaling 公司）。其他主要试剂：PMSF 蛋白抑制酶（北京康为世纪生物科技有限公司），Pierce ECL 发光液（Thermo Scientific），脱脂奶粉（BD 公司），血脂四项（南京建成生物工程研究所有限公司），血糖试纸（京都血糖试纸），剩余试剂均为分析纯（广州齐云生物技术有限公司）。主要仪器：低氧分压系统（美国Hypoxico公司），玻璃匀浆器（广州化学试剂厂），高速低温离心机（上海安亭科学仪器厂），半自动生化分析仪（美国Rayto 公司），便携式血糖仪（日本京都公司），Bio-rad 电泳仪（两块胶）及转膜仪（美国Bio-rad 公司），万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），Image J图像分析软件。

1.2 构建营养性肥胖大鼠模型

清洁级健康雄性大鼠SD 大鼠[SCXK（粤）2011-0015]100只，由南方医科大学实验动物中心提供，体重170～220 g。动物分笼饲养，5只/笼，自然光照节律，自由摄食、饮水，温度22～24°C，湿度40%～55%，大鼠随机分为普通膳食组（CON，20 只）和高脂膳食造模组（DIO，80 只），并每天固定时间称量食物，每周固定时间称重，并做记录。普通膳食为国家标准啮齿类动物干燥饲料（南方医科大学动物实验中心提供）；高脂膳食：蔗糖20%，猪油15%，胆固醇1.2%，胆酸钠0.2%，酪蛋白10%，磷酸氢钙0.6%，石粉0.4%，预混料0.4%，基础饲料52.2%[广东省医学实验动物中心提供，SCXK（粤）2013-0002]，高脂膳食供能比：蛋白质17.5%，脂肪37%，碳水化物45.5%。根据肥胖易感模型筛选规律，高脂膳食组大鼠的体重超过普通膳食组大鼠体重的20%即可作为营养性肥胖大鼠[12]。持续性喂养7周后，从CON组和DIO组分别随机挑选10只和18只，眼眶取血，测其血糖、血脂，结合大鼠体重、BMI[13][BMI=体重（kg）/体长2（m2）]，进而评价造模效果。本研究数据显示，高脂膳食造模组79.6%成功诱导大鼠的营养性肥胖。

1.3 动物分组及取材

营养性肥胖大鼠模型建立成功后，高脂膳食造模组（60 只）分为6 组，每组10 只：常氧高脂膳食安静组（NHQ）、常氧高脂膳食运动组（NHE）、16.3%低氧高脂膳食安静组（HGQ1）、16.3%低氧高脂膳食运动组（HGE1）、13.3%低氧高脂膳食安静组（HGQ2）、13.3%低氧高脂膳食运动组（HGE2），持续干预8 周，均进行高脂膳食饲养。运动组则进行8周跑台耐力训练，适应1周后，均以20 m/min、40 min/d、5 d/w、跑台坡度为0，进行耐力运动。本实验采用美国Hypoxico公司制造的低氧分压系统（HTS），构建人工常压低氧环境。末次训练24 h后处死大鼠，大鼠主动脉取血，3000 r/min离心10 min，收集血清；取一侧腓肠肌置液氮速冻，后于-80°C超低温冰箱保存，待测。

1.4 血脂、血糖含量测定

半自动生化仪测定血脂四项（南京建成公司试剂盒）：总胆固醇（COD-PAP 法）、高密度脂蛋白胆固醇（磷钨酸镁沉淀法）、低密度脂蛋白胆固醇（聚乙烯硫酸沉淀法）、甘油三酯（GPO-PAP 法）。京都血糖仪测定血糖含量（京都血糖试纸）。

1.5 Western blotting 法测定蛋白PGC-1α、AMPK 及pAMPK

取100 mg 腓肠肌，加入1 ml RIPA 裂解液和10 μl的PMSF蛋白抑制酶，置于冰上，使用玻璃匀浆器进行人工研磨并裂解20 min；4°C ，12000 r/min 离心10 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度，随后保存于-20°C 冰箱待用。BCA法测定蛋白浓度后与上样缓冲液于沸水中煮5 min，使蛋白变性。采用5%浓缩胶、12%分离胶电泳，湿转法将其转至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4°C 孵育过夜[一抗（PGC-1α、AMPKα、pAMPKα）比例：1∶1000；GAPDH：1∶3000]；次日TBST缓冲液清洗，HRP标记二抗室温孵育2 h（山羊抗兔IgG/HRP：1∶3000）。TBST清洗后，暗室ECL发光，X光片显影定影，并进行扫描。Imagine J 读取蛋白条带的积分灰度值，PGC-1α的Western blotting结果用目的蛋白积分灰度值与内参蛋白积分灰度值的比值表示，AMPK磷酸化程度则用pAMPK灰度值/AMPK灰度值表示。

1.6 数据统计

采用SPSS17.0 统计学软件包进行统计，结果用平均数±标准差（±s）。GraphPad Prism 5 进行数理统计及图像生成，构建营养性肥胖大鼠模型时，CON组与DIO 组（指标：体重、体长、BMI、BG、TG、TC、LDL-c、HDL-c）两组之间采用独立样本t检验，CON 组与DIO组两组间的摄食量采用重复测量方差分析；采取运动与低氧干预时，以运动和O2浓度作为影响因素，进行两因素（2×3）方差分析，分析每个因素的主效应以及两因素间的交互作用，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 高脂诱导营养性肥胖模型构建成功

7周高脂膳食饲养后，DIO组大鼠形态学变化表现为体重、BMI、体长显著高于CON 组（P＜0.01，表1），且体重增长超过CON 组大鼠20%；血液生化相关指标表现为血糖（BG）、甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）含量显著增加（P＜0.01，P＜0.05），而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）略有降低，但差异无统计学意义（表2）。两组大鼠摄食量无显著性差异（图1）。结果提示高脂膳食诱导的营养性肥胖大鼠模型建立成功[14]。

表1 7周末两组大鼠体重、体长和BMI比较

表2 两组大鼠血脂及血糖比较（mmol/l）

图1 建模期两组大鼠摄食量比较

2.2 低氧运动干预后营养性肥胖大鼠骨骼肌pAMPK/AMPK、PGC-1α的蛋白表达

图2显示，在AMPK 磷酸化程度方面，HGE1 组高于NHQ 组（P＜0.05），而HGE2 组显著性高于NHQ 组、NHE 组、HGQ1 组（P＜0.01）。而在PGC-1α蛋白表达方面，HGE2 组显著性高于NHQ 组（P＜0.01），NHE 组和HGE1 组也高于NHQ 组（P＜0.05）；HGE2 组高于NHE组（P＜0.05）；HGE2 组和HGE1 组均高于HGQ1 组（P＜0.01或P＜0.05）。

图2 低氧运动干预后营养性肥胖大鼠骨骼肌pAMPK/AMPK、PGC-1α蛋白表达

2.3 低氧运动干预后营养性肥胖大鼠骨骼肌pAMPK/AMPK、PGC-1α蛋白表达的双因素方差分析结果

大鼠骨骼肌pAMPK/AMPK 的校正模型Sig.小于0.05，说明该检测指标组间差异具有统计学意义。运动对大鼠骨骼肌磷酸化AMPK蛋白表达有显著性影响（P＜0.05），表明运动能有效促进肥胖大鼠骨骼肌AMPK的磷酸化。

表3 低氧运动干预后营养性肥胖大鼠骨骼肌pAMPK/AMPK、PGC-1α蛋白表达的双因素方差分析结果

3 分析与讨论

目前，关于肥胖大鼠的研究模型主要有三种：特殊药物所诱导的肥胖模型、遗传性肥胖模型以及高脂膳食所致的肥胖模型[15，16]。随着社会发展，人类生活水平提高，饮食习惯趋于高脂化，而高脂膳食模型与人类饮食习惯相似，同时，高脂膳食会引起某些肥胖易感基因活化，因此，高脂膳食所致的营养性肥胖模型具有十分重要的意义。此外，高脂膳食构建肥胖模型具有方便、价格低、可靠的特点，因而也是动物肥胖模型研究的常规模型。本研究中经7周高脂膳食饲养后，79.6% DIO组大鼠体重增长超过CON 组体重的20%，符合Chandler等的研究成果：高脂组体重超过正常组20%[12]。此外，两组间BMI 具有显著差异，血糖血脂均显著增加，与相关文献报道一致，提示营养性肥胖大鼠建模成功[14，17]。

AMPK 是一种高度保守的细胞能量代谢调控器，在调节细胞生长及机体能量代谢中起着重要作用，可降低血糖和血脂水平，调控骨骼肌中脂肪酸摄入与脂肪酸氧化分解，在维持机体能量稳态中发挥关键作用[7，18]。因此，AMPK可被影响机体能量稳态的因素或细胞分子激活，如氧化应激、激素、运动、缺氧等[19-21]。Skeffington 等研究发现低氧暴露可显著增强机体AMPK 的表达，以提高机体对低氧暴露所致的能量失衡的适应能力[22]；收缩刺激和运动可活化AMPK，并促进FAT/CD36和脂蛋白脂酶（lipoprteinlipase，LPL）表达，进而增强骨骼肌脂肪酸摄入，同时也提高线粒体对脂肪酸的氧化能力[23]。通过上述研究可知，改变外界环境，抑或通过增强机体能量消耗的方式，如耐力性运动等，均可高效活化AMPK。由此，我们选择将低氧暴露与耐力性运动两者叠加，探寻低氧运动是否会对AMPK 的活化作用更显著。实验结果显示，8 周常氧耐力运动、低氧暴露或低氧运动干预后，大鼠骨骼肌中AMPK 磷酸化蛋白表达量均有所提高，且低氧运动干预后AMPK磷酸化程度更加显著，表明在低氧、运动、低氧结合运动三种干预方式中，低氧结合运动干预对机体骨骼肌AMPK 的活化作用效果最强，这与我们的研究假设相符。然而我们在比较低氧（P=0.050）、运动（P=0.017）两因素对AMPK 的影响作用时，发现运动对AMPK 磷酸化作用更显著，两者叠加时则无统计学意义，由此我们推测低氧环境下运动时，可能会存在其他细胞分子被活化，进而影响AMPK磷酸化水平。同时，本实验设置两种低氧浓度，实验结果显示无论低氧暴露或者低氧运动干预，13.3%组大鼠骨骼肌AMPK磷酸化水平均高于16.3%组，这可能与不同浓度低氧暴露刺激调控AMPK相关细胞分子的活化程度相关。

PGC-1α是人体重要的能量代谢“分子开关”之一，主要分布于能量需求较高的组织中，如骨骼肌、心脏等，可与多种核受体或非核受体结合，在防治肥胖、代谢综合症、2型糖尿病等疾病过程中起重要作用[24]。骨骼肌作为机体能量代谢最活跃的组织之一，富含PGC-1α，而PGC-1α在骨骼肌线粒体发生、糖代谢、脂肪酸氧化等能量代谢网络中均具有重要调控作用。研究显示，营养不良、运动、低氧等可影响PGC-1α的表达水平。Greene等发现耐力运动可激活骨骼肌中PGC-1α，增强FAT/CD36、CPT-1、MCAD等脂肪酸氧化代谢相关酶的活性，增强脂肪酸氧化能力，加剧骨骼肌能量代谢[25，26]。低氧状态下，PGC-1α可通过低氧诱导因子1（HIF-1）调节机体骨骼肌线粒体生成和糖、脂代谢等[27]。我们的实验结果显示低氧暴露或/和运动均可提高骨骼肌PGC-1α蛋白表达，其中13.3%低氧运动组大鼠PGC-1α蛋白表达最高，且显著高于常氧运动组，也高于16.3%低氧运动组但无统计学意义。由此可见，运动过程中增加低氧干预手段可有效增强骨骼肌PGC-1α蛋白的表达，进而影响骨骼肌能量代谢稳态。而我们在比较低氧（P=0.294）、运动（P=0.075）两因素对PGC-1α的影响作用时，发现两者对PGC-1α的影响作用无统计学意义，由此可见低氧或运动对PGC-1α的影响作用并无显著性区分。进行不同浓度低氧干预时，我们发现：虽然低氧浓度越低，PGC-1α蛋白表达也随之升高，然而并无统计学意义，由此我们推测不同低氧浓度对PGC-1α蛋白表达虽均具有促进作用，但可能并非单纯呈正向作用，可能与低氧状态下HIF-1活性相关，这仍需我们进一步研究。目前，关于低氧运动对骨骼肌PGC-1α调控作用的研究较少，尚需继续探讨。

采用AICAR（AMPK 激动剂）处理体外培养的骨骼肌细胞后，PGC-1α表达水平显著升高[28]。此外，也有研究显示AMPK可通过磷酸化PGC-1α的Thr117（苏氨酸）和Ser538（丝氨酸）位点，激活并调节PGC-1α的功能[11，29]。以上研究可表明PGC-1α是AMPK下游靶点之一。研究显示，对骨骼肌细胞进行急性收缩刺激时，可活化AMPK-PGC-1α通路，进而提高PGC-1α表达[30]。在Combes等[31]研究中，受试者分别进行30 min持续性或间歇性大强度运动，结果发现间歇性运动中骨骼肌的AMPK表达显著性高于持续性运动，同时，与一次性持续运动相比，一次性大强度间歇运动可更显著地上调PGC-1α表达。而PGC-1α作为线粒体发生及脂肪酸氧化代谢的重要调控分子，许多研究显示持续性运动对PGC-1α的影响更显著，这与Combes 等[31]的研究并不相符，提示我们运动对线粒体生物发生及脂肪酸氧化代谢的长期适应性还有待研究，AMPK作为PGC-1α上游调控因子，可能会因干预方式改变而使该信号通路发生相应调整。目前，已有学者对常氧下运动对AMPK-PGC-1α的影响作用进行研究，此外，单纯低氧暴露对AMPK-PGC-1α的影响作用也有所研究。Chen等[32]研究发现间歇性低氧暴露可上调骨骼肌中AMPKPGC-1α信号通路的表达，与Chaillou 等[33]研究结果一致。然而，低氧结合耐力运动对大鼠骨骼肌AMPKPGC-1α的影响，目前尚未见相关报道。本研究结果显示，不同浓度低氧运动刺激下，AMPK-PGC-1α表达均成上升趋势，且PGC-1α活性变化趋势与AMPK的磷酸化趋势一致，表现出AMPK-PGC-1α的联动反应，与运动或低氧暴露干预下AMPK-PGC-1α表达的变化一致，推测低氧运动对AMPK-PGC-1α的作用效应，可能与运动、低氧暴露两种干预方式均为正相关效应有关。本研究进行了两种浓度低氧运动干预，结果显示：随着低氧浓度降低，AMPK-PGC-1α表达均有所增高，而不同低氧浓度对AMPK、PGC-1α的影响略有不同。由此我们推测：低氧结合运动调控AMPK-PGC-1α信号通路可能与其他细胞信号通路存在联动效应，低氧激活AMPK、PGC-1α具有一定特异性，但由于本研究并未进行信号通路的阻断或增强，因此仍需继续探究低氧运动对AMPK-PGC-1α的机制。此外，本课题组曾进行15.4%及14.5%低氧运动干预[34]，我们对不同浓度低氧运动干预减脂方面的数据进行比较，发现低氧浓度越低，肥胖大鼠血脂及体重降低越显著，且与机体脂肪酸氧化代谢相关的细胞分子表达越高，由此可见，低氧、运动与骨骼肌脂肪酸氧化代谢可能存在着正相关的调控作用，然而目前不同浓度低氧对机体的调控作用并未完全阐释清楚，因此，仍需我们继续探究更多不同浓度低氧对机体脂代谢及骨骼肌脂肪酸氧化代谢的作用机理。

4 结论

低氧运动可能通过增强AMPK 磷酸化，进而上调PGC-1α蛋白表达，这可能是低氧运动改善营养性肥胖大鼠骨骼肌脂代谢紊乱的机制之一。