4周有氧运动对Apelin基因敲除鼠糖耐量和骨骼肌糖代谢相关基因表达的影响

何诗依 李铁瑛 严露 侯影 张缨

北京体育大学运动人体科学学院（北京100084）

Apelin 是血管紧张素Ⅱ1 型受体相关蛋白——APJ的内源性配体，由77个氨基酸组成，含有前体多肽序列和分泌信号序列[1]。Apelin 广泛分布于中枢神经和外周组织器官中，如神经、心血管、骨骼肌和脂肪等[2，3]。以往的研究主要集中在Apelin 作为脂肪因子与肥胖、糖尿病，作为内皮因子与心血管和作为内分泌因子与神经、肺功能等方面的调节关系上[3，4]。研究发现，Apelin与机体糖代谢调节有着密切的关系[5]。Apelin基因缺失鼠的葡萄糖耐量和胰岛素耐量则明显降低[6]。

有氧运动在调节葡萄糖代谢中发挥关键性作用[7]。那么，Apelin缺失是否影响有氧运动对糖代谢的调节呢？骨骼肌作为机体的动力源，在运动维持血糖平衡中起着重要作用[8]。近年来的研究证明肌肉收缩可增加Apelin mRNA 表达[9]。胰岛素抵抗大鼠进行8 周的跑台运动后，胰岛素抵抗减弱，并且比目鱼肌和腓肠肌中Apelin 蛋白表达呈显著性增加[10]。张靓等对肥胖大鼠进行10周跑台运动干预的研究发现，运动后肥胖大鼠与未进行运动的肥胖大鼠相比，比目鱼肌中Apelin 表达增加，并且肌肉中毛细血管生成增多[11]。另有文献报道，喂食高脂饲料的Apelin 转基因鼠其骨骼肌葡萄糖氧化能力显著高于野生鼠[12]。然而，运动是否介导Apelin调控骨骼肌糖代谢，目前仍不清楚。

因此，本研究通过4周有氧运动训练，观察安静和运动两种状态下Apelin 敲除（KO）和野生（WT）小鼠葡萄糖耐量水平和骨骼肌糖代谢相关基因表达的变化，以探究运动调控糖耐量和骨骼肌糖代谢的可能机制。

1 研究对象和方法

1.1 实验动物和分组

健康8 周龄的成年C57BL/6J WT 和Apelin KO 鼠各40 只。进一步分为野生安静组、野生运动组、敲除安静组和敲除运动组4 组，每组20 只，每组10 只用于糖耐量实验（GTT），剩余10 只用来测量骨骼肌糖代谢相关基因mRNA 和蛋白表达。Apelin KO 鼠由美国Mutant Mouse Resource and Research 中心提供，并由中国医学科学院实验动物研究所保种繁殖，WT来自于北京维通利华实验动物技术有限公司。体重为22±2 g，每笼3～4只饲养，室温20～25℃，相对湿度50%～70%，每天光照12 h，自由进食和饮水。该动物实验方案被北京体育大学动物伦理委员会批准。

1.2 运动方案

运动组在正式实验开始前熟悉3天跑台运动。运动组进行持续4 周的跑台运动，每周训练6 天，运动组在训练前以及运动两周后采用实验动物呼吸检测系统（美国Columbus Instruments）测量最大摄氧量，调节运动强度为70%～75%最大摄氧量强度，即前两周的运动速度为15 m/min，后两周的运动速度为20 m/min，坡度为5°，每天运动1小时。

1.3 测试指标及方法

1.3.1 小鼠的基因型鉴定

取4周龄所有小鼠的尾尖组织，放入到装有75 μl碱液的离心管中，95℃孵育40 min。结束后加入75 μl中和液，常温静置5 min，得到提取的小鼠基因组DNA。进而，样品做PCR扩增，引物序列如下：

将以上所有引物混合成为混合引物。PCR反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix12.5 μl，10 μmol/l，混合引物2.5 μl，模板DNA 2.5 μl，加ddH2O 7.5 μl补足25 μl。1%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭作为分子量标记物，做电泳鉴定。

表1 不同基因型引物序列（5’-3’）

1.3.2 葡萄糖耐量试验（glucose tolerance test，GTT）

运动组在最后一次运动后休息48 小时（自由进食），安静组和运动组小鼠禁食16 h后，腹腔注射浓度为100 mg/ml 的D-葡萄糖（1g/kg 体重）溶液。注射前（0 min）及注射后15、30、45、60、90 和120 min 共7 个时间点，采用三诺GA-6 血糖仪（Sinocare，中国）检测小鼠尾静脉末梢血糖水平；血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）=（0 min血糖值+15 min血糖值）×15/2+（15 min 血糖值+30 min 血糖值）×15/2+（30 min血糖值+45 min 血糖值）×15/+（45 min 血糖值+60 min血糖值）×15/2+（60 min血糖值+90 min血糖值）×30/2+（90 min 血糖值+120 min 血糖值）×30/2。AUC 代表葡萄糖耐量水平，AUC值越大，代表葡萄糖耐量水平越差。

1.3.3 RT-PCR测定mRNA表达

运动组在最后一次运动后休息48 小时（自由进食），安静组和运动组小鼠脱颈处死，取小鼠小腿骨骼肌（混合肌）。800 μl 的Trizol 试剂（Invotrogen）中放入50 mg 骨骼肌，剪碎匀浆后，用三氯甲烷、异丙醇、75%酒精进行分离提纯总RNA，用Nanadrop 2000（Thermo Scientific，USA）测定RNA 的纯度和浓度，选用逆转录试剂盒（Toyobo，FSQ101）将RNA 逆转录成cDNA，随后放到-20℃保存，选用的仪器是PCR 扩增仪（A100；杭州朗基科学仪器有限公司，MG96+/Y）。

采用美国ABI7500荧光定量PCR仪和Toyobo公司生产的荧光染料反应体系（SYBR Green Realtime PCR Master Mix），以及德国QIAGEN 公司引物：Apelin （QT00111762），Glut4 （QT01044946），Hk2（QT00155582） ，Pfkm （QT00159754） ，Gbe1（QT00252924），Phka1 （QT00143514）和18S rRNA（QT01036875）。反应体系包括：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，引物2 μl，CDNA 模版2 μl，ddH2O 6 μl。目的基因表达结果用比较CT法相对定量，目的基因=2-△△CT[13]。

1.3.4 Western blot 测定蛋白表达

将骨骼肌组织放入RIPA中，剪碎匀浆，12000 rpm离心30 min 后提取总蛋白。采取BCA 比色方法测量胞浆蛋白浓度（BCA Protein Assay Reagent，23225，Pierce，Thermo Fisher Scientific，USA）。根据蛋白浓度调整上样体积，上样蛋白总量为20 μg。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus 凝胶，NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液分离目的蛋白，随后将目的蛋白转移到NC膜上（采用美国Invitrogen 公司的iBot Gel Transfer System）。丽春红对NC 膜进行染色标记后，然后采用5%的BSA 进行封闭1 h；用相对应的一抗进行孵育，比例分别为Apelin（1∶1000；PA5-51077，Invitrogen ）；Glut4（1∶2000；ab654，Abcam）；β-actin（1∶2000；sc-477778，Santa Cruz Biotechnology）。洗脱后与相对应的二抗反应1 h，洗脱后加发光液（ECL western blot substrate，piece，USA）到NC 膜上，放入BIO-RAD 仪器中进行图像分析。

1.4 数据处理

所有数据采用SPSS13.0 软件进行统计学处理。Apelin mRNA 和蛋白含量采用独立样本t检验分析。将鼠种（WT鼠、KO鼠）和运动方式（安静、运动）作为组间主效应，分别对小鼠GTT 的血糖和AUC、Glut4 表达及糖代谢相关基因mRNA相对含量进行双因素方差分析；若鼠种与运动方式两因素有交互作用，采用LSD简单效应检验；若无交互作用，则采用独立样本T检验分析数据。数据结果用平均数±标准差（±s）来表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4周有氧运动对Apelin KO鼠GTT影响

由图1数据统计结果可知，除45 min 血糖值和血糖AUC 外，其余时间点血糖值在鼠种与运动方式之间没有交互作用，采用独立样本T检验。图1A的GTT 结果显示，敲除安静组在45 min、60 min、90 min、120 min 这4 个时间点的血糖值显著高于野生安静组（P＜0.05）。野生运动组相比野生安静组各个点血糖没有显著性变化；敲除运动组在45 min和60 min这两个时间点血糖显著低于敲除安静组（P＜0.05）；敲除运动组和野生运动组相比，GTT 中各点的血糖值都没有出现显著性变化。血糖曲线下面积（AUC）分析表明，敲除安静组和野生安静组相比，AUC显著性增加（P＜0.01）；经过4周有氧运动后，敲除运动组和敲除安静组相比，AUC显著性降低（P＜0.05）（图1B）。

2.2 Apelin KO 鼠基因型验证以及野生小鼠骨骼肌内Apelin mRNA和蛋白的表达量

图2A 为不同基因型小鼠鉴定结果，DNA 条带在331bp 的为Apelin KO 鼠，DNA 条带位于176bp 的为野生型鼠。野生型小鼠运动组和安静组相比，Apelin mRNA和Apelin蛋白表达没有出现显著性变化（图2B、图2C）。

图1 各组小鼠GTT血糖值和血糖曲线下面积图

2.3 4周有氧运动对Apelin KO鼠骨骼肌Glut4 mRNA和蛋白的影响

由图3数据统计结果可知，Glut4 mRNA 相对表达量和蛋白表达在鼠种和运动方式之间没有交互作用，采用独立样本T检验。如图3所示：敲除安静组和野生安静组相比，骨骼肌内Glut4 mRNA和蛋白表达都显著性降低（P＜0.05）。经过4周有氧运动后，野生运动组和野生安静组相比Glut4 mRNA 和蛋白表达没有出现显著性变化；敲除运动组和敲除安静组相比，Glut4 mRNA 含量显著性增加（P＜0.05），但是其蛋白表达没有明显变化。敲除运动组和野生运动组相比，骨骼肌内Glut4 mRNA和蛋白表达显著性减少（P＜0.05）。

图2 Apelin KO鼠基因型验证以及各组骨骼肌Apelin mRNA和蛋白的表达

2.4 4 周有氧运动对Apelin KO 鼠骨骼肌糖代谢相关基因表达的影响

由图4数据统计结果可知，Gbe1，Phka1，Hk2 和Pfkm mRNA 相对表达量在鼠种和运动方式之间没有交互作用，采用独立样本T 检验。如图4所示，敲除安静组和野生安静组相比，骨骼肌内Gbe1，Phka1，Hk2和Pfkm 的mRNA 表达显著性减少（P＜0.05）。经过4 周有氧运动后，敲除运动组与敲除安静组相比，Gbe1，Phka1和Hk2 mRNA表达显著性提高（P＜0.05）；同时敲除运动组和野生运动组相比，骨骼肌内Gbe1，Hk2 和Pfkm三个基因mRNA的表达显著性降低（P＜0.05）。

图3 各组Glut4 mRNA和蛋白表达变化

图4 各组糖代谢相关基因mRNA表达的变化

3 分析讨论

3.1 Apelin基因敲除对糖耐量和骨骼肌糖代谢的影响

葡萄糖耐量反映机体对血糖浓度平衡的调节能力。研究已发现Apelin KO 鼠的糖耐量和野生鼠相比显著性降低，呈现糖耐量受损现象[6]，我们的实验结果与其相一致。骨骼肌占人体体重的40%以上，是摄取和利用葡萄糖的主要部位，在体内糖代谢平衡中发挥着重要作用。Apelin 与骨骼肌葡萄糖代谢密切相关，骨骼肌成肌细胞C2C12中加入Apelin能够促进其吸收葡萄糖的能力[6]。葡萄糖转运蛋白4（Glucose Transporter-4，Glut4）作为葡萄糖进入肌细胞的重要转运体，其表达水平可影响组织细胞对葡萄糖的摄取，2型糖尿病人慢肌纤维中Glut4 蛋白表达量降低是造成其骨骼肌摄取葡萄糖能力下降的重要原因[14]。Gbe1和Phka1分别是编码糖原分支酶（Glycogen branching enzyme 1，Gbe1）和磷酸激酶调节亚单位a1（Phosphorylase b kinase regulatory sbunit alpha 1，Phka1）的基因。Gbe1 主要参与合成糖原α-1，6-糖苷键从而促进糖原分支的形成[15]；Phka1 促进糖原的分解[16]。骨骼肌内Gbe1和Phka1基因表达的增加能够增加骨骼肌对于葡萄糖的吸收[17]。而糖酵解是葡萄糖能量代谢的重要途径。Hk2和Pfkm可分别编码骨骼肌中糖酵解途径中重要的限速酶己糖激酶（Hexokinase 2，Hk2）和磷酸果糖激酶肌同工酶（phosphofructokinase muscle isozyme，Pfkm）。有研究报道2 型糖尿病大鼠的骨骼肌内Hk2表达水平显著下降[18]以及糖耐量受损小鼠骨骼肌Pfkm表达也显著降低[19]。在本研究中，Apelin KO鼠骨骼肌Glut4 mRNA 和蛋白以及糖代谢相关基因Gbe1，Phka1，HK2 和Pfkm 的mRNA 表达与野生鼠相比显著下降。以上表明，Apelin 缺失会影响骨骼肌转运和葡萄糖的利用。而骨骼肌葡萄糖摄取和代谢能力的下降可能是导致Apelin KO鼠糖耐量受损的重要原因。

3.2 4 周有氧运动对WT 鼠糖耐量和骨骼肌Apelin 及糖代谢相关基因表达的影响

运动的方式、时间以及强度不同会影响机体糖代谢对运动的适应，引起运动干预后不同的糖耐量变化。MacDonald 等对假性手术对照SD 大鼠进行为期4周递增强度的运动后，其GTT 的AUC 显著减少[20]。而Bradley等对WT鼠进行6周自主转轮运动后，发现糖耐量的变化不大[21]。同样，在我们的研究中，WT鼠经过4周有氧运动后GTT的AUC水平没有发生显著变化。这可能是由于正常的WT 小鼠自身的糖代谢处于稳态状态，而本实验的运动强度和运动时间没有打破其自身的稳态，因此，4周运动训练对其糖耐量水平影响较小。

骨骼肌作为内分泌器官，研究已发现，运动可促进人体[9]、胰岛素抵抗大鼠[10]和肥胖大鼠[11]骨骼肌Apelin表达，Apelin 被认为是运动可诱导产生的一个新的肌肉因子[9]。但是，也有文献发现6 周运动可抑制Zucker肥胖大鼠红肌纤维中Apelin 蛋白的表达，对白肌纤维内Apelin蛋白表达没有影响[22]。以上表明运动强度、时间、种属以及肌纤维类型等都可能影响骨骼肌的Apelin 表达。在我们的实验中，4 周有氧运动并没有引起WT 骨骼肌（混合肌）Apelin mRNA 和蛋白表达的显著性变化，也没有引起骨骼肌Glut4，Gbe1，Phka1，HK2和Pfkm mRNA和Glut4蛋白表达发生显著性变化。结果提示该运动训练方案对正常WT 鼠Apelin 表达以及骨骼肌糖代谢的调节作用不大。

3.3 4 周有氧运动对Apelin KO 鼠糖耐量和骨骼肌糖代谢相关基因表达的影响

有氧运动可促进糖代谢，调节能量代谢[23，24]，是糖尿病、肥胖预防和治疗的基石[25，26]。大量的研究证明有氧运动能够改善因不同原因导致的糖耐量下降。高脂饮食可导致WT 鼠的糖耐量下降，而10 周有氧跑台运动显著提高糖耐量水平[27]。6 周跑轮运动可显著降低饮食诱导的肥胖小鼠的糖耐量水平，并提高其胰岛素敏感性[21]。我们的实验结果显示，4周有氧运动能够显著改善Apelin 缺失造成的糖耐量下降，可使其糖耐量水平达到WT鼠水平。

另外，4周有氧运动可显著提高Apelin KO 鼠骨骼肌内Glut4，Gbe1，Phka1 和Hk2 mRNA 表达，表明该运动训练在一定程度上促进了骨骼肌葡萄糖摄取能力、糖原或葡萄糖代谢，可能对改善因Apelin 缺失造成的小鼠糖耐量受损起到积极作用。但是，4周运动训练后Apelin KO 鼠糖代谢相关基因表达的变化与同样训练的WT 鼠相比，仍然存在显著性下降的差异，这说明在骨骼肌中Apelin的缺失仍然会影响有氧运动对骨骼肌糖代谢的调节作用。在本实验中，有氧运动除了对骨骼肌糖代谢有一定改善作用外，对其他组织器官，如肝脏、胰脏等可能也有积极的调节作用，这些因素共同促进了Apelin KO鼠糖耐量的改善，使得Apelin KO鼠的糖耐量水平达到正常WT 鼠水平。关于其具体的分子机制仍有待于进一步研究。

本研究发现有氧运动训练可有效改善Apelin缺失造成的糖耐量受损。但在实验中我们没有按照肌纤维类型进行取材，对骨骼肌糖代谢的研究也不够全面，存在着一定的局限性。在今后的研究中，将进一步深入研究Apelin在有氧运动训练对骨骼肌糖代谢的调节作用。

4 结论

Apelin KO鼠的糖耐量受损，骨骼肌葡萄糖代谢相关基因的表达显著降低；4周有氧运动可明显改善Apelin KO 鼠的糖耐量降低，对骨骼肌糖代谢相关基因表达有一定的积极促进作用。