IKnife-REIMS联用技术对南极犬牙鱼脂质组学轮廓检测

陈 康，王海星，张燕平，李诗言，王 扬，饶 伟，沈 清,*

（1.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省麻醉重点实验室，温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325000；3.浙江省水产质量检测中心，浙江 杭州 310023；4.沃特世科技（上海）有限公司，上海 200126）

南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoides），亦称美露鳕、南极鳕鱼，属辐鳍鱼纲、鲈形目、南极鱼科、南极犬牙鱼属，主要分布在南美、澳洲以及次南极区群岛海域，生存水域深及2 500 m，以少骨和肉质白嫩晶莹剔透而闻名[1-2]。犬牙南极鱼属的经济价值比较高，目前的市场平均价格高于金枪鱼，被称为“白金渔业”[3]。对南极犬牙鱼资源的商业开发和利用，国际上自20世纪70年代中期开始至今约40年的历史[4]。我国受条件限制，还未进行实际的渔业捕捞生产，国内也鲜见其渔业资源和加工利用方面相关报道。

脂质组学通过系统分析细胞、体液、组织等脂质及其代谢物，识别关键的脂生物标志物，反映生物种间差异或特定条件下脂质的整体变化[5]。目前，脂质组学的分析方法主要有薄层色谱法、气相色谱-质谱联用、软电离质谱技术、核磁共振法等[6-10]。基于电喷雾离子化的“鸟枪法”和正相或亲水色谱质谱联用法是脂质组学常用的分析方法[11-12]。然而，目前的脂质组学质谱方法对样品前处理要求较高，步骤较为复杂，无法满足研究人员对快速、高通量、实时检测的需求。

快速蒸发离子化质谱（rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS）技术是一种无需制备或液相色谱分离的新型原位电离质谱技术，使用iKnife、电热探头等手持采样装置直接蒸发样品表面，产生信息丰富的气溶胶并通过离子传输管路进入质谱质量分析器，数秒内提供分析物的准确分子质量谱[13-14]。以REIMS为基础的生物组织分析无须任何样品前处理，通常仅需几秒钟的时间即可完成数据采集与分析并实现生物组织识别，精确度达到90%～98%[15]。目前，REIMS已经成功应用于临床组织切除、肿瘤诊断、微生物鉴定、食品鉴别等，为脂质组学研究提供了一种全新的研究方法和研究思路[16-18]。国内已有媒体介绍REIMS的新闻通讯，但鲜见相关技术研究报道。

本实验基于REIMS技术，使用iKnife电切南极犬牙鱼肌肉组织，使其表面脂质快速蒸发并进入质谱检测，获得脂质组学轮廓图谱并进行结构鉴定和相对定量。由于目前国内鲜见REIMS相关研究报道，研究成果可促进REIMS理论与技术发展，拓宽其在生命科学、食品科学等研究领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极犬牙鱼组织切片样品 浙江大洋世家股份有限公司。

甲醇、乙腈、丙二醇（均为色谱纯） 美国Merck公司；亮氨酸脑啡肽 美国Sigma公司；实验用水为经Millipore超纯水仪制备的超纯水。

1.2 仪器与设备

Xevo G2-XS四极杆飞行时间质谱仪（配有iKnife手持采样装置） 美国Waters公司；Pump11 elite针泵注射进样器 美国Harvard公司；Milliplus 2150超纯水处理系统 美国Millipore公司。

1.3 质谱条件

iKnife质谱技术两大突出优势为动态实时和无需样品前处理，本实验的南极犬牙鱼样品0 ℃冰水解冻后即可直接检测。使用iKnife电刀切割南极犬牙鱼组织切片表面，生成含有大量复杂离子混合物的气溶胶，经Venturi泵氮气驱动，采用正交方式经PTFE管引入质谱端口后与Kanthal A1灯丝（1.1 Ω，3 V，500 ℃）碰撞，随后脂质离子进入质谱仪StepWave装置并有质量分析器检测分析，实验装置如图1所示。以丙二醇-亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂，经针泵注射进样器以0.1 mL/min的流量引入端口，用于清洗杂质、提高信号强度、锁定质量校正；质谱仪扫描时间为1 s；质量扫描范围为m/z 100～1 200；所有数据均以负电离模式收集。

图1 基于iKnife直接采样南极犬牙鱼获取脂质组学轮廓的REIMS设备装置图Fig. 1 Setup of iKnife based REIMS for lipidomic profiling of Patagonian toothfish

1.4 数据处理

将质谱图经MassLynx进行峰匹配、滤噪、中心化和质量校准处理，结果保存为txt格式。根据质谱数据得到主要离子峰的m/z和峰面积信息，结合高丰度离子二级质谱碎片、Lipid MS Predictor和LipidMap脂质分子数据库比对确定或推测脂质的结构信息，部分低丰度离子二级质谱信号较弱，因此结构未能完全确认。数据采集软件Masslynx 4.1和统计分析软件LiveID由美国Waters公司提供。

2 结果与分析

2.1 iKnife离子化条件优化

南极犬牙鱼肌肉组织低脂特性对REIMS检测结果的影响较大。前期实验研究发现，iKnife在电切禽畜类肌肉或内脏组织时，离子信号响应较强、信噪比较高；电切鱼类组织，尤其是犬牙鱼等低脂鱼类肌肉组织时，脂质离子较难被检测到，噪音影响显著。因此，首先对iKnife电切条件进行优化，调整输出功率、切割速率、切割长度，以获得稳定、可靠的南极犬牙鱼肌肉组织脂质组学轮廓图谱。

表1 响应面试验设计方案及结果Table 1 Experimental design and results for RSM

使用响应面法优化试验参数，以Box-Behnken设计原理，选取磷脂离子母峰m/z 885.55的信噪比作为响应值，输出功率、切割速率、切割长度为试验因素，设计优化不同试验条件组合，结果如表1所示。

利用Design Expert 8.0软件对表1中的试验数据进行回归分析及拟合，得到的信噪比回归方程为：

Y=46.44+0.19A-0.30B+0.51C+1.87AB-0.6AC+0.47C-2.07A2-2.84B2-3.47C2

由表2方差结果得出模型（P＜0.000 1）极显著，失拟项（P＝0.160 4）不显著，R2为0.976 6，该回归方程与实际数据拟合度较高。

根据图2所示的3 个因素响应面与等高线图，最优化分析后得出最佳提取条件为输出功率25.08 W、切割速率0.49 mm/s、切割长度1.03 cm，信噪比预测值为46.465 6。为便于实际操作，将实验条件调整为：输出功率25 W、切割速率0.50 mm/s、切割长度1.0 cm。在最佳条件下进行5 次重复实验，验证得到实际信噪比平均值为46.32，此优化条件有效。

表2 回归方程参数方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation

图2 m/z 885.55信噪比的响应面及等高线图Fig. 2 Response surface and contour plots showing the interactive effect of instrumental parameters on the signal-to-noise ratio of m/z 885.55

2.2 脂肪酸离子分析

图3 m/z 200～400 脂肪酸离子REIMS图Fig. 3 REIMS spectra of fatty acid ions in the m/z range from 200 to 400

使用iKnife手持采样的REIMS技术无需任何样品前处理，通过对组织样品表面离子化，实时获得质谱轮廓图，经LiveID等软件识别，并对特征离子峰降维、建模后，可实现未知样品的实时鉴定与准确度评分。由于前端并未串联液相色谱等分离技术，目前REIMS相关研究主要以定性为主。因此，本实验研究目的主要为获得低脂鱼类南极犬牙鱼的脂质组学轮廓图，对各脂质分子的绝对含量定量方法未做深入研究。

表3 南极犬牙鱼中脂肪酸的相对含量及结构解析Table 3 Relative contents and probable attributions of fatty acids in D. eleginoides

通过对南极犬牙鱼肌肉组织进行电切离子化，扫描范围m/z 100～1 200，同时以亮氨酸脑啡肽（m/z 554.261 5）为内标锁定质量并校准质量轴。如图3所示，区域内离子较多，且基质噪音也较为明显；通过对其鉴定和积分，得到结构和相对含量见表3。脂肪酸离子特征表现为，根据偶氮规则，其在质谱图中质量数通常为奇数。实验共检出脂肪酸离子17 种，其中信号响应强度最大的为m/z 327.23，相对含量达到了17.81%，经鉴定其结构为FA 22∶6，即所熟知的DHA。其次分别为m/z 255.23（FA 16∶0，9.81%）、m/z 281.25（FA 18∶1，9.09%）。m/z 375、389等疑似为超长链脂肪酸FA 24∶3 Ep（2.79%）、FA 26∶3（2.96%），其存在可能与南极犬牙鱼受极寒环境胁迫，促使其代谢产生长链脂肪酸以提高体液流动性相关[19]；相关假设尚需生物学进一步验证。

2.3 磷脂离子分析

对质谱图4降噪、去同位素等处理，筛选峰面积大于3.00×105的离子峰，根据其分子质量测定值推算其可能的化学结构，并使用二级质谱进行验证。以m/z 883.53为例，其离子质量与磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）离子[PI 38∶5-H]-（C47H80O13P-，883.534 2）最为接近，通过子离子扫描将母离子解离得到，可观察到由m/z 883.53断裂的脂肪酸链子离子m/z 283.2（FA 18∶0）和m/z 301.1（FA 20∶5），碳原子数和双键数与前期推测38∶5吻合，故此可确认m/z 883.53为[PI 38∶5-H]-。通过这种方法可对大多数磷脂离子结构进行确认，部分低丰度离子因为子离子信号响应不足未做二级质谱确认。南极犬牙鱼肌肉组织中共鉴定磷脂离子峰10 种，质量范围m/z 736.49～909.55，根据峰面积采用归一化法计算相对丰度，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为3.28%～6.21%。信号最强离子峰m/z 885.55经鉴定为[PI 38∶4-H]-，相对丰度达到了19.30%；其次为磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）离子m/z 790.54（[PE 40∶6-H]-），相对丰度为15.24%。通常鱼类组织中磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）含量最高，PE次之，PI、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的含量相对较少[20-21]。然而本实验中PC和PE分子检出较少，原因可能是iKnife输出能量较高，电切过程中通过电能传输导致PC丢失胆碱基团，PE丢失氨基基团，最终生成磷脂酸（phosphatidyl acid，PA）离子[PA-H]-[22]。该推论印证了结果中较多[PA-H]-离子的检出，如m/z 747.50（[PA 40∶6-H]-）、m/z 763.56（[PA O-42∶5-H]-）等。Balog等[23]使用iKnife-REIMS联用技术对牛肉、马肉等动物肌肉组织进行脂质轮廓分析，检出的脂质同样以PE、PA、PI为主。

图4 m/z 650～1 000磷脂离子REIMS图Fig. 4 REIMS spectra of phospholipid ions in the m/z range from 650 to 1 000

表4 南极犬牙鱼中磷脂的相对含量及结构解析Table 4 Relative contents and probable attributions of phospholipids in D. eleginoides

2.4 方法学验证

为验证本实验基于REIMS的南极犬牙鱼脂质组学轮廓方法的可靠性，选取主峰脂肪酸离子m/z 281.25、m/z 327.24和磷脂离子m/z 790.54、m/z 885.55为特征脂质离子峰对灵敏度、选择性、精确度等参数进行方法学验证[24]。对由于组织样品无法构建标准逐级稀释体系，本实验采用目标脂质信噪比为指标研究方法灵敏度。研究结果（表5）显示，目标脂质的信噪比为35.4～95.3，方法灵敏度较高，鉴于南极犬牙鱼为低脂鱼类，对于脂质含量更高的中脂、高脂鱼类理论上同样适用。通过计算目标离子的实际测量值和理论值的偏差确定高分辨质谱的选择性，目标脂质离子的偏差为4.17×10－6～9.78×10－6，表明方法分辨率高、选择性较好，使用相对分子质量对脂质结构鉴定具有较大的指导意义。方法精密度通过日内和日间精密度测量，使用iKnife连续平行切割南极犬牙鱼肌肉组织5 次，并计算目标脂质离子峰面积的RSD，得到日内精密度；以相同实验条件连续平行测试7 d，计算RSD获得日间精密度。其中日内精密度的RSD为3.7%～5.6%，日间精密度的RSD为5.9%～7.3%，本实验方法精密度好，检测结果稳定。

表5 REIMS南极犬牙鱼脂质组学轮廓检测方法验证Table 5 Validation of REIMS method for lipidomic profiling of D. eleginoides

3 结 论

建立了iKnife和REIMS联用技术用于检测南极犬牙鱼的脂质组学轮廓。通过响应面优化各项参数后，实现了低脂肌肉组织中脂质的离子化，成功检出17 种脂肪酸离子和10 种磷脂离子。目前该技术尚处于研究探索阶段，产生的脂质组学轮廓中，根据各个磷脂分子离子峰的强弱经归一化法处理后反映了不同磷脂分子的相对含量情况，对建立鱼类脂质的特征指纹谱图具有重要意义。该方法无需样品前处理，可实现南极犬牙鱼肌肉组织脂质组学轮廓的实时检测，方法选择性、灵敏度、稳定性均较优，为脂质组学研究提供了新的技术手段。