基于UFLC-Triple TOF MS/MS技术分析竹节参中皂苷类成分

陈佳丽，谈梦霞，邹立思，刘训红*，陈舒妤，石婧婧，王程成，梅余琪

（南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023）

竹节参别名竹节人参，系五加科植物竹节参（Panax japonicus C.A.Mey.）的干燥根茎，收载于2015年版《中国药典》，具有散瘀止血，消肿止痛，祛痰止咳，补虚强壮之功效，用于治疗痨嗽咯血，跌扑损伤，咳嗽痰多，病后虚弱等症[1]。但由于诸多因素，竹节参野生资源逐年减少并濒临枯竭。自20世纪90年代竹节参野生转家种栽培技术研究获得成功以后，竹节参人工栽培面积扩大，现已被湖北省定为地道药材GAP基地建设品种[2-3]。研究表明，竹节参主要含有皂苷、糖类、氨基酸和挥发油等化学成分[4]。其中皂苷类成分为主要药效成分，具有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗心肌缺血[7]等多方面的药理活性。人参属药材因皂苷类成分的广泛药理活性而受到关注与研究，国内外学者研究主要集中于皂苷类成分分离与鉴定、药理作用和质量评价等方面，亦有用液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用法对竹节参皂苷类成分进行定性分析的研究报道，共定性或鉴定出13 个皂苷类成分[8]。竹节参中皂苷类成分常见的分析方法主要有高效液相色谱（highperformance liquid chromatography，HPLC）法[9-10]、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）[11-12]及LCMS[13]等。HPLC法操作简便、灵敏度较高，主要用于皂苷类成分的含量测定；NMR作为一种对已知或未知化合物具有较强结构解析能力的检测手段，多用于对未知化合物的结构分析鉴定，但NMR大多需对样品进行较复杂且耗时的提取、分离等前处理步骤；LC-MS样品前处理简单，而且集LC高分离能力、MS高灵敏度和高选择性于一体，对已知或未知化合物均可较准确地分析与鉴定，已广泛应用于中药的定性与定量分析。其中，三重四极杆串联飞行时间（triple quadrupole-time of flight，Triple-TOF）质量分析器，三重四极杆对前体离子分析具有较高分辨率，TOF对产物离子分析具有较高分辨率，Triple-TOF相比于单纯的三重四极杆或飞行时间质量分析器，具有更高的灵敏度、准确度和数据采集速率，能快速记录连续质谱图和产物离子图，可根据提供的准分子离子及其产生的碎片离子分子质量信息，在结合标准品与文献参考的基础上，实现对化合物的快速鉴定分析。

本研究采用超快速液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱（ultra-fast liquid chromatography coupled with triple quadrupole-time of flight tandem mass spectrometry，UFLCTriple TOF MS/MS）技术对竹节参中皂苷类成分进行分析，根据高分辨质谱提供的准分子离子及其产生的碎片离子精确分子质量、色谱保留时间，结合标准品比对与参考相关文献数据，初步鉴定出原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果烷型及奥寇梯木醇型共53 种皂苷成分，并推测其可能的裂解途径及规律，旨在探究竹节参的药效物质基础和建立其药材品质的综合评价体系提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三七皂苷R1（批号：lw16080802）、人参皂苷Re（批号：lw16081605）、人参皂苷Rg1（批号：lw15121303）、拟人参皂苷F11（批号：lw16081901）、人参皂苷Rf（批号：lw16052502）、人参皂苷Rb1（批号：lw16060402）、人参皂苷Rg2(20S)（批号：lw15123004）、人参皂苷Rh1（20S）（批号：lw16081802）、人参皂苷Rc（批号：lw15121701）、人参皂苷Rh1(20R) （批号：lw15121903）、人参皂苷Ro（批号：lw16050405）、人参皂苷Rb3（批号：lw16012704）、假人参皂苷RT1（批号：lw17033006）、竹节参皂苷IV（批号：lw17030208）、人参皂苷Rd（批号：lw16051604）、竹节参皂苷IVa（批号：lw16081901）、人参皂苷F4（批号：lw16040702）、人参皂苷F2（批号：lw16081105）、人参皂苷Rg3(20R)（批号：lw15121701）、人参皂苷Rk1（批号：lw16022102）、人参皂苷Rg5（批号：lw17012304）、人参皂苷CK（批号：lw16072902）（纯度均大于98%）南京良纬生物技术有限公司；三七皂苷R2(20S)（批号：P20N6F6255）（纯度大于98%） 上海源叶生物技术有限公司。

竹节参样品：于2017年10月采自湖北省恩施市栽培基地（北纬30°3’49”，东经109°51’41”），经南京中医药大学刘训红教授鉴定为五加科植物竹节参（Panax japonicus C.A.Mey.）的根茎。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯） 德国默克公司；甲醇（批号：143135）（色谱纯） 江苏汉邦科技有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

SIL-20A XR UFLC仪 日本Shimadzu公司；Triple TOFTM5600 System-MS/MS高分辨四极杆飞行时间质谱仪（配有Peakview 1.2数据处理系统，电喷雾离子源） 美国AB Sciex公司；ME36S型电子分析天平（1/100万）、BSA2245型电子分析天平（1/10万） 德国赛多利斯公司；Q-500B高速多功能粉碎机 上海冰都电器有限公司；KQ-500B超声波清洗机（500 W、40 kHz） 昆山超声仪器有限公司；H1650-W高速离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Milli-Q超纯水制备仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱SynergiTMHydro-RP 100 Å柱（2.0 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相0.1%甲酸-水（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～10 min，10%～35% B；10～14 min，35%～42% B；14～24 min，42%～95% B；柱温40 ℃；流速0.4 mL/min；进样量2.0 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源负离子模式；质量扫描范围m/z 50～1 500；离子源温度550 ℃；气帘气流速40 L/min；雾化气流速55 L/min；辅助气流速55 L/min；喷雾电压-4 500 V；去簇电压-100 V。

1.3.3 对照品溶液制备

分别取各对照品适量，精密称定，置于5 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液溶解制成对照品溶液。分别精密吸取对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液溶解制成5 μg/mL混合对照品溶液。

1.3.4 供试品溶液制备

精密称定样品粉末0.5 g（过60 目筛），置于25 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液10 mL，密闭，称质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）60 min，放置冷却，再次称质量，用70%甲醇溶液补足质量损失，摇匀，过滤，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.4 数据统计

实验数据采用Peakview 1.2软件进行处理，裂解途径推导图采用ChemDraw Ultra 7.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 竹节参中皂苷类成分结构鉴定

图1 竹节参70%甲醇溶液提取物在负离子模式下的基峰图Fig. 1 Base peak chromatogram (BPC) of 70% methanol extract of P. japonici Rhizoma in negative ion mode

按照1.3节实验条件对竹节参中皂苷类成分进行分离与分析，如图1所示。通过供试品的色谱保留时间，高分辨质谱提供的准分子离子峰及碎片离子峰精确分子质量信息，与对照品比对，确定了23 个皂苷成分；根据高分辨质谱提供的精确分子质量，确定可能分子结构式，再依据碎片离子信息，参考相关文献数据，并结合HDMB数据库检索，共推测出30 个皂苷成分，如表1所示。

2.2 皂苷类成分的质谱解析

图2 竹节参中皂苷结构类型Fig. 2 Structures of different types of saponin aglycone in P. japonici Rhizoma

竹节参中皂苷类型主要有原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果烷型、奥寇梯木醇型，如图2所示。多数皂苷含有至少一个糖链，一般在不同取代位置上与葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）等单糖或寡糖相连。皂苷类成分苷元部分较为稳定，一般较大压力下也仅失去糖碎片（162、146、132 u），多数皂苷中呈现相似的单糖或寡糖碎片裂解规律。例如，人参皂苷Rb1（化合物21）的裂解碎片中除表1碎片m/z 945、783、765、621、459，还可观察到碎片m/z 323、221、179、161、119、101，其中，m/z 323、221可以推断为Glc-Glc裂解产生的碎片，m/z 179、161、119、101可以推断为Glc裂解产生的碎片。人参皂苷Rc（化合物26）同样地除表1中碎片m/z 945、783、621，可观察到碎片m/z 191、161、149、131、101，其中m/z 191可以推断为Glc-Ara的裂解碎片，m/z 149、131为Ara的裂解碎片，m/z 101为Glc的裂解碎片。人参皂苷Rb3（化合物30）除表1中碎片m/z 945、783、765、621、459，可观察到碎片m/z 191、161、149、131、101，其中可推断出m/z 191为Glc-Xyl的裂解碎片，m/z 149、131为Xyl的裂解碎片，m/z 101为Glc的裂解碎片。综合多数皂苷糖裂解碎片，可推断出相似结论：碎片离子m/z 179、161、119、101，提示为Glc；m/z 323、221提示为Glc-Glc；m/z 191提示为Glc-Ara或Glc-Xyl；149、131提示为Ara或Xyl[18,27,43-44]。

2.2.1 原人参二醇型皂苷

共鉴定了18 个原人参二醇型皂苷，分别为表1中的化合物3、5、11、19、21、22、26、30、35、38、41、42、43、46、47、48、50和52。原人参二醇型皂苷在一级质谱中产生较强的[M+HCOO]-、[M-H]-离子，C-3(R1)、C-20(R2)位上的糖基取代基不同程度地裂解。

表1 竹节参药材供试品溶液中皂苷类成分的UFLC-Triple TOF MS/MS鉴定结果Tab1e 1 Identification of saponins in P. japonici Rhizoma by UFLC-Triple TOF MS/MS

续表1

以人参皂苷Rb1、人参皂苷Rs3、人参皂苷Rg3(20R)为例说明裂解途径。化合物21的保留时间为11.76 min，准分子离子峰为m/z 1 107.599 5[M-H]-，分别失去1、2、3、4分子Glc得到碎片离子m/z 945、783、621、459，失去2分子Glc和1分子H2O得到碎片离子m/z 765，人参皂苷Rb1的裂解途径如图3A所示。与对照品比对，结合文献数据确定为人参皂苷Rb1。

化合物47的保留时间为17.22 min，准分子离子峰为m/z 871.509 1[M+HCOO]-，失去C-3位上糖基连有的1分子乙酰基（Ac）得到碎片离子m/z 783，继而失去1分子H2O得到碎片离子m/z 765，失去C-3位上糖基连有的1分子Ac、1分子Glc得到碎片离子m/z 621，再失去1分子Glc得到碎片离子m/z 459，结合文献数据推测为人参皂苷Rs3。

化合物48的保留时间为17.28 min，准分子离子峰为m/z 829.495 6[M+HCOO]-，依次失去C-3位上的1、2分子Glc，得到碎片离子m/z 621、459。通过对照品比对，结合文献数据确定化合物48为人参皂苷Rg3(20R)。

图3 人参皂苷Rb1（A）和原人参二醇型皂苷（B）的裂解途径Fig. 3 Fragmentation pathways of ginsenoside Rb1 (A) and glycosides of protopanaxadiol (PPD) (B)

通过对上述18 个原人参二醇型皂苷裂解过程的推测与比对，可知原人参二醇型皂苷母核较稳定，一般碎片断裂为糖碎片或中性丢失1分子H2O，若连有乙酰基的糖链，先脱去Ac，再脱去H2O和糖，得到m/z 459[C30H51O3]-的特征碎片离子，原人参二醇型皂苷的裂解途径如图3B所示。

2.2.2 原人参三醇型皂苷

图4 三七皂苷R2(20S)（A）和原人参三醇型皂苷（B）的裂解途径Fig. 4 Fragmentation pathways of notoginsenoside R2 (20S) (A) and glycosides of protopanaxatriol (PPT) (B)

共鉴定了21 个原人参三醇型皂苷，分别为表1中的化合物4、6、7、8、9、10、15、16、17、18、20、23、24、25、28、32、39、40、44、45和53。原人参三醇型皂苷在一级质谱中产生较强的[M+HCOO]-、[M-H]-离子，二级质谱中C-6(R1)、C-20(R2)位上的糖基取代基不同程度地裂解。

以丙二酰基人参皂苷Rg1、三七皂苷R2(20S)、人参皂苷Rf为例说明裂解途径。化合物10的保留时间8.71 min，准分子离子峰为m/z 885.488 4[M-H]-，失去C-6位上的1分子CO2得到碎片离子m/z 841，失去C-6位上糖基连有的1分子丙二酰基（Ma）得到碎片离子m/z 799，再失去1分子H2O得到碎片离子m/z 781，失去C-6位上的1分子Ma、1分子Glc得到碎片离子m/z 637，再失去1分子H2O得到碎片离子m/z 619，失去C-6位上的1分子Ma、C-6和C-20位上各1分子Glc得到苷元碎片离子m/z 475。通过与文献数据比对推测为丙二酰基人参皂苷Rg1。

化合物15的保留时间为10.91 min，其准分子离子峰m/z 845.492 2[M+HCOO]-，分别失去C-6位上的1、2分子Glc得到碎片离子m/z 637、475。通过与对照品比对，结合文献数据确定为人参皂苷Rf。

化合物17的保留时间为11.36 min，准分子离子峰为m/z 815.480 9[M+HCOO]-，失去1分子Xyl得到碎片离子m/z 637，继而失去1分子Glc得到碎片离子m/z 475，三七皂苷R2(20S)的裂解途径如图4A所示。通过与对照品比对，并结合文献数据确定其为三七皂苷R2(20S)。

通过对上述21 个原人参三醇型皂苷裂解规律的推导与比对，可知原人参三醇型皂苷母核较稳定，一般碎片断裂为糖碎片，若糖链上连有其他丙二酰、乙酰基等取代基，先脱去取代基，再脱去糖，在原人参三醇型的裂解中产生m/z 475[C30H51O4]-的特征碎片离子，原人参三醇型皂苷裂解途径如图4B所示。

2.2.3 齐墩果烷型皂苷

共鉴定了10 个齐墩果烷型皂苷，分别为表1中的化合物12、27、29、31、33、34、36、37、49和51。齐墩果烷型皂苷在一级质谱中产生较强的[M+HCOO]-、[M-H]-离子，二级质谱中C-3(R)、C-28酯基(R2)位上的糖基取代基不同程度地裂解。

以竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖为例说明其裂解途径。化合物34的保留时间为13.06 min，准分子离子峰为925.483 5[M-H]-，失去C-28酯基相连的1分子Glc、C-3位上与GlcUA相连的1分子Ara和1分子H2O，得到碎片离子m/z 613，再失去GlcUA上的1分子CO2得到碎片离子m/z 569。通过与对照品比对，并结合文献数据比对后确定为竹节参皂苷IV。

化合物36的保留时间为13.55 min，其准分子离子峰为m/z 793.439 9[M-H]-，失去1分子Glc得到碎片离子m/z 631，再失去GlcUA上的1分子CO2和1分子H2O得到碎片离子m/z 569，竹节参皂苷IVa的裂解途径如图5A所示。通过与对照品比对，结合文献数据确定为竹节参皂苷IVa。

化合物51的保留时间为18.85 min，其准分子离子峰为m/z 663.411 7[M+HCOO]-，失去C-28酯基位上连有的1分子Glc得到碎片离子m/z 455，与文献数据比对推测为齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖（PJS-1）。

图5 竹节参皂苷IVa（A）和齐墩果烷型皂苷（B）的裂解途径Fig. 5 Fragmentation pathways of chikusetsusaponin IVa (A) and glycosides of oleanolic acid (B)

通过对上述10 个齐墩果烷型皂苷裂解规律的推导与比对，可知齐墩果烷型皂苷母核较稳定，一般碎片断裂为糖基、中性丢失H2O和CO2。在C-3位上有糖基取代基的齐墩果烷型皂苷在裂解中会产生m/z 569[C35H53O6]-的特征碎片离子，齐墩果烷型皂苷的裂解途径如图5B所示。

2.2.4 奥寇梯木醇型皂苷

共鉴定了4 个奥寇梯木醇型皂苷，分别为表1中的化合物1、2、13和14。奥寇梯木醇型皂苷在一级质谱中多产生较强的[M+HCOO]-离子，二级质谱中C-6(R1)位上的糖基取代基不同程度地裂解。

化合物2的保留时间为6.91 min，其准分子离子峰子m/z 861.486 5[M+HCOO]-，分别失去1、2分子Glc得到碎片离子m/z 653、491，珠子参苷R1的裂解途径如图6A所示。与文献数据比对，推测化合物2为珠子参苷R1。

化合物1、13、14的保留时间分别为5.28、10.61、10.87 min，准分子离子峰分别为子m/z 1 023.541 4[M+HCOO]-、831.477 7[M+HCOO]-、845.493 1[M+HCOO]-，分别失去2分子Glc、1分子Xyl、1分子Rha得到碎片离子m/z 653，通过与文献数据比对推测化合物1、13分别为叶三七皂苷B、珠子参苷R2/假人参皂苷RT2，与对照品对照并与文献数据比对确定化合物14为拟人参皂苷F11。

通过对上述4 个奥寇梯木醇型皂苷裂解规律的推测与比对，可知奥寇梯木醇型皂苷母核较稳定，一般断裂为糖碎片，易产生m/z 653[C36H61O10]-的碎片离子，最终可能会产生m/z 491 [C30H51O5]-的特征碎片离子，奥寇梯木醇型皂苷的裂解途径如图6B所示。

图6 珠子参苷R1（A）和奥寇梯木醇型皂苷（B）的裂解途径Fig. 6 Fragmentation pathways of majonoside R1 (A) and glycosides of ocotillone (B)

3 结 论

UFLC-Triple TOF MS/MS技术可提供准分子离子及碎片离子的元素组成等结构信息，提高结构解析的准确性及分析速率，易于发现传统分析中被遗漏或者忽略的化合物，在中药复杂组分的鉴定研究中具有一定优势及应用前景。但该多级质谱分析技术在结构鉴定及裂解方面仍然存在一定局限性。例如，取代基取代不同位点的同分异构体难以确认，取代基上基团断裂位置及顺序尚不能确定，裂解途径的合理解释等相关文献较少。因此，采用UFLC-Triple TOF MS/MS技术对化合物结构鉴定及裂解推导仍需进一步研究，通过归纳相关化合物裂解方式及规律，为中药中相似成分的结构分析提供理论依据。

本研究采用UFLC-Triple TOF MS/MS技术对竹节参中皂苷类成分进行分析，初步鉴定出原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果烷型及奥寇梯木醇型共53 种皂苷成分，其中，珠子参苷R1、人参皂苷B1、越南人参皂苷R7、人参皂苷Re4/西洋参皂苷L17、丙二酰人参皂苷Rg1、人参皂苷Rs1/Rs2、乙酰人参皂苷Rg1、拟人参皂苷RT3/人参皂苷F3、sanchirhinoside A3/A4(20S)、三七皂苷K、人参皂苷F1、越南人参皂苷R3、人参皂苷Rg6、人参皂苷F4、人参皂苷Rs3、人参皂苷Rg3(20R)、拟人参皂苷Rp1、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和人参皂苷CK在竹节参成分分析中为首次报道。结果表明，竹节参与同属药材人参、三七和西洋参成分构成相似，而其中齐墩果烷型皂苷较为丰富，且相较于其他三类皂苷，相应峰响应强度较高，即该类成分相对含量较高。通过归纳上述53 种皂苷的裂解模式及规律，可初步推断各类皂苷通过不断丢失取代基位置上的H2O、CO2、糖基及乙酰、丙二酰基等，裂解至4 种不同类型的苷元。

本研究采用UFLC-Triple TOF MS/MS技术对竹节参中皂苷类成分进行分析，根据相关质谱数据、对照品及文献，初步鉴定出原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果烷型及奥寇梯木醇型共53 种皂苷成分并推测其可能裂解途径及规律，以期进一步探究竹节参药效物质基础及建立其品质评价体系。