luxS基因对盐胁迫下植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响

孙思睿，万 峰，赵鹏昊，侯雨佳，范小飘，梁 玉，孟祥晨*

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸杆菌的一种，常用作益生菌，广泛存在于谷物、乳肉制品、果蔬制品及发酵饮料中，也常用于生产某些发酵产品，是一种重要的工业微生物。在食品生产中乳酸菌会面临多种环境胁迫，如加工过程中的高压胁迫[1]、发酵过程中的酸胁迫[2]以及贮藏过程中的冷胁迫[3]等，其中盐胁迫也逐渐引起人们的关注。食盐是泡菜、酱制品、发酵肉制品及干酪等发酵制品中必不可少的添加物，主要作用是调味和延长贮存期；然而一定浓度盐会增加环境渗透压，易使乳酸菌细胞失水，细胞质浓缩，会在一定程度上影响其正常生理功能。因此，乳酸菌对盐的耐受性在一定程度上会影响其发酵特性，对生产意义重大。

群体感应（quorum sensing，QS）是乳酸菌与外界环境进行信息交流的重要调控系统，通常由信号分子和双组分调节系统（包括组氨酸蛋白激酶和相应调节因子）两部分组成。AI-2是一类重要的信号分子，可以进行细菌间的沟通，其中LuxS蛋白酶是AI-2合成的关键酶，因此其编码基因luxS在QS系统中具有重要作用[4]。当信号分子的浓度达到一定阈值后，便会激活特定基因的表达，以调控某个单个细菌无法完成的生理功能[5]，如生物发光[6]、生物膜形成[7]、细菌素的合成[8]、耐受性[9]及黏附性[10]等。luxS介导的QS过程已被证明可以调节基因表达[11]，且该基因序列高度保守，当前研究发现luxS基因与耐酸能力有很大关系，但对细菌素合成及盐耐受性的影响知之甚少。

L. plantarum KLDS1.0391是从传统发酵乳制品中分离得到的1 株生理特性良好的产细菌素菌株，由全基因组信息得知[12]，该菌具有多种与胁迫相关的蛋白，包含5 个胆盐胁迫相关基因、13 个温度胁迫相关基因以及4 个渗透压胁迫相关基因等。前期研究结果证实该菌含有luxS基因[13]；并已发现：QS可调节该菌与其他细菌共培养时细菌素的合成[13]，但还不清楚该菌盐胁迫耐受性是否受QS系统调节。

本研究通过测定野生株和luxS基因缺失突变株在不同浓度盐胁迫下的生长及细菌素合成情况，探究luxS基因在L. plantarum KLDS1.0391应对NaCl胁迫时的作用，从而揭示在NaCl胁迫时L. plantarum中QS系统对该菌株生长及代谢的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

L. plantarum KLDS1.0391野生株及luxS基因缺失突变株均保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC6633 中国食品药品检定研究院。

1.1.2 培养基与试剂

MRS培养基及营养肉汤培养基配制方法参照文献[14-15]。

氯霉素（chloramphenicol，CAP）、溶菌酶 美国Amresco公司；PrimerScript®RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒、DL5000 DNA Marker 宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌总RNA提取试剂盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶 天根生化科技有限公司；琼脂糖、过氧化氢酶 美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯或生化纯。

1.2 仪器与设备

DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；0.22 μm微孔滤膜 美国Bio-Rad公司；GL-21M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所；DYY-10C型电泳仪北京市六一仪器厂；凝胶成像系统 美国UVP公司；ZHWY200B型全温度恒温培养摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；HVE-8D型全自动高压灭菌锅 日本HIRAYAMA公司；9700 PCR扩增仪 美国Applied Biosystem公司；Step One PlusTM实时荧光定量PCR仪 美国Thermo Fisher公司；LGJ-1冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；Delta320 pH计 瑞士梅特勒-托利多有限公司；UV-2401PC型紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 luxS基因缺失突变株的构建与扩培

参照文献[16]，并对构建成功的突变株进行氯霉素抗性平板及PCR扩增验证。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸210 s，33 个循环后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。分别将L. plantarum KLDS1.0391野生株及luxS基因缺失突变株于MRS及含氯霉素的MRS培养基中37 ℃活化3 代，进行之后实验。

1.3.2 盐耐受能力比较

将活化后的野生株和突变株过夜培养，分别取10 mL菌液在4 ℃、8 000 r/min离心10 min，收集菌体，经磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤2 次后等体积重悬于含0%、2%、3%、4%、6%以及8% NaCl的磷酸盐缓冲液中，于37 ℃孵育24 h，分别测定在孵育0、8、16 h和24 h时2 株菌的活菌数，并按下式计算存活率：

1.3.3 生长性能比较

分别将野生株和突变株以2%的接种量接种于含0%、2%、3%、4%和6% NaCl的MRS培养基中，37 ℃培养36 h，每隔4 h取样，在波长600 nm处测定OD值，并绘制生长曲线。

1.3.4 产细菌素能力比较

在1.3.3节取样间隔，每个样品取10 mL菌液，12 000 r/min离心15 min收集无细胞发酵上清液，按参考文献[17]采用双层平板打孔法测定抑菌活性，以B. subtilis作为上层指示菌，打孔后上样量为100 μL。

1.3.5 部分基因表达的比较

1.3.5.1 PCR引物设计与合成

以16S rDNA作为内参基因，目的基因为细菌素结构基因plnEF以及QS调节基因plnD和plNC8HK。引物设计见表1[18]。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.3.5.2 总RNA提取

分别将野生株与突变株在含0%、2%及4% NaCl的MRS中培养24 h后，取菌液（要求所收集菌体数量小于1×109CFU/mL）于4 ℃、12 000 r/min离心2 min，弃上清液收集菌体。RNA提取过程参照天根细菌总RNA提取试剂盒（DP430）说明书，分别提取上述菌体的总RNA。

1.3.5.3 逆转录合成cDNA

首先在反转录前去除基因组DNA，然后在冰浴上按PrimerScript®RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书混合体系并合成cDNA，合成后于4 ℃保存。

1.3.5.4 实时荧光定量PCR检测

依据SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行PCR反应液的配制。反应体系总体积为20 μL。PCR参数为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34 s，共40 个循环数[16]。在任一盐浓度胁迫下，均以野生株样品为校准样品，以同浓度下luxS基因突变株样品为待测样品，通过2-ΔΔCt分析不同待测样品基因的表达差异[19]。

1.4 数据分析

结果均为3 次独立重复实验数据的平均值，用 ±s表示。采用Excel及Origin 8.5进行数据分析和作图，并利用SPSS 17.0程序进行方差分析。P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 luxS基因缺失突变株的验证

前期研究已经成功构建luxS基因缺失突变株[16]，由于质粒自身性质不稳定且基因敲除后具有一定复原性，在长时间贮存后性状易发生改变，因此在实验前对突变株进行验证。在含4 mg/L CAP的抗性平板上划线结果显示，野生株在抗性平板上不生长，而luxS基因缺失突变株正常生长（图1）。

图1 luxS基因缺失突变株抗性平板验证Fig. 1 Verification of luxS gene deletion mutant strain by resistant plate

分别挑取抗性MRS平板上生长的突变株单菌落及普通MRS平板上生长的野生株单菌落进行PCR验证，结果显示，野生株在2.9 kb处有一条明亮条带为luxS基因片段（图2泳道1），而突变株分别在2.9 kb和3.4 kb处有两条明亮的特异性条带（图2泳道2）。由于L. plantarum KLDS1.0391具有2 个luxS基因片段，突变株的2 条特异性条带分别为同源重组的转化子与luxS基因片段，表明打靶片段仍同源重组在基因组中，因此该突变株为L. plantarum KLDS1.0391 luxS单基因缺失突变株。

图2 luxS基因缺失突变株菌落PCR验证Fig. 2 Verification of luxS gene deletion mutant strain by PCR

2.2 luxS基因对菌株NaCl耐受能力的影响

在6 种不同质量分数NaCl胁迫条件下，L. plantarum KLDS1.0391野生株与luxS基因缺失突变株在胁迫24 h内存活率的变化如图3所示。在孵育过程中，无论luxS基因缺失与否，L. plantarum KLDS1.0391存活率均随NaCl质量分数的升高而降低，且野生株对NaCl具有较好的耐受能力，在8% NaCl质量分数下胁迫24 h后存活率仍能达到80%以上。

图3 NaCl胁迫对野生株与luxS基因缺失突变株存活率的影响Fig. 3 Effects of different concentrations of NaCl stress on survival rates of the wild-type strain and its mutant

不添加NaCl时，在孵育的24 h中，两株菌的存活率均有微弱下降，这可能是由于没有营养物质导致其中某些细胞个体的衰亡（图3a）。在2% NaCl条件下孵育24 h后，存活率低于不添加NaCl组，但两株菌存活率仍能达到98%以上，且无显著性差异（P＞0.05）（图3b），此结果表明：在NaCl质量分数低于2%时，luxS基因对该菌株耐受NaCl胁迫的影响不显著。当NaCl质量分数不小于3%时，野生株对NaCl的耐受能力极显著高于突变株（P＜0.01）。野生株在3%、4%、6%及8% NaCl质量分数下胁迫24 h后存活率分别为97.95%、95.55%、95.10%和83.47%；而luxS基因缺失突变株的存活率分别为92.05%、89.13%、75.15%和67.46%（图3c～f），实验结果表明，luxS基因在L. plantarum菌株耐受NaCl胁迫中起作用。

2.3 luxS基因对菌株在NaCl胁迫下生长的影响

由盐耐受能力实验结果可知，在8% NaCl质量分数胁迫下菌株存活率显著下降，表明该条件严重影响其存活能力，进而抑制菌株生长代谢，因此在后续研究中仅讨论其他5 个质量分数梯度。由图4可知，无论是野生株还是突变株，盐胁迫均会在一定程度上延缓或抑制L. plantarum KLDS1.0391菌体的生长。野生株在含2%NaCl的MRS中生长16 h后进入稳定期（图4b），较不含NaCl延迟4 h（图4a），但在稳定期后的OD600nm值无显著差异（P＞0.05）；而对于其他NaCl质量分数，不仅到达稳定期的时间较不含NaCl时有所延迟，OD600nm值也显著降低（P＜0.05）（图4c～e）。对于luxS突变株，任何质量分数的NaCl胁迫均会延长其进入稳定期的时间，且显著降低菌体数量（P＜0.05）；生长能力均弱于野生株，且差异显著（P＜0.05）。而突变株相对于野生株而言，二者达到各生长阶段的时间几乎保持一致，无延迟现象；但在达到稳定期后，各NaCl质量分数下活菌数均为野生株大于突变株。在6% NaCl质量分数下，菌株在指数生长阶段维持较长时间，表明高质量分数NaCl胁迫严重影响了L. plantarum KLDS1.0391的生长。野生株在含0%、2%、3%、4%和6% NaCl的MRS培养基中培养进入稳定期后OD600nm值分别为1.767、1.766、1.657、1.588和1.182；突变株则分别为1.705、1.677、1.618、1.544、1.101。

图4 NaCl胁迫对野生株与luxS基因缺失突变株生长的影响Fig. 4 Effects of different concentrations of NaCl stress on growth of the wild-type strain and its mutant

2.4 luxS基因缺失对菌株在NaCl胁迫下细菌素合成能力的影响

随着L. plantarum KLDS1.0391进入生长对数期，野生株细菌素合成量逐渐增加，当进入稳定期后细菌素合成量最大，且随着细菌的衰亡，细菌素合成能力也逐渐减弱（图5a）；在2% NaCl胁迫下，细菌素合成量高于未添加NaCl（图5b）；而当NaCl质量分数大于2%时，则在一定程度上抑制细菌素的合成，NaCl胁迫下L. plantarum KLDS1.0391细菌素最大合成量的顺序依次为：2% NaCl＞0% NaCl＞3% NaCl＞4% NaCl＞6% NaCl（图5c～e）。对于突变株，虽然细菌素在菌体生长过程中的合成趋势与野生株相同，但是当其面对NaCl胁迫时，细菌素合成能力均较未胁迫时有所降低，且随NaCl质量分数提高，细菌素合成量也逐渐下降，差异显著（P＜0.05）。

图5 NaCl胁迫对野生株与luxS基因缺失突变株细菌素合成的影响Fig. 5 Effects of different concentrations of NaCl stress on bacteriocin biosynthesis of the wild-type strain and its mutant

2.5 luxS基因对菌株在NaCl胁迫下细菌素合成相关基因表达的影响

图6 NaCl胁迫对野生株与luxS基因缺失突变株细菌素相关基因表达的影响Fig. 6 Effects of different concentrations of NaCl stress on expression of bacteriocin biosynthesis-related genes in the wild-type strain and its mutant

根据上述细菌素合成能力研究结果，选取具有代表性的促进细菌素合成的NaCl质量分数2%、抑制细菌素合成的NaCl质量分数4%为研究对象，以未胁迫作为对照。结果表明：当L. plantarum野生株及突变株分别在不含NaCl的MRS中培养24 h时，编码细菌素的结构基因plnEF与调节细菌素合成相关基因plnD和plNC8HK表达量差异不显著（P＞0.05）（图6a）；当NaCl质量分数为2%和4%时，luxS基因缺失导致基因plnEF、plnD和plNC8HK的表达量极显著下调（P＜0.01）（图6b、c）。结果表明，存在盐胁迫时，luxS基因会影响L. plantarum KLDS1.0391中细菌素合成相关基因的转录水平，进而影响该菌在盐胁迫条件下细菌素的合成。

3 讨 论

许多发酵食品如发酵肉、酸菜、干酪等通常会在发酵过程中添加一定量的NaCl，使得环境中的渗透压升高，影响细胞结构并引起生理损伤，这会在一定程度上对乳酸菌的生长与代谢造成胁迫。从本实验结果可以看出，无论野生株亦或是luxS基因缺失突变株，随着NaCl质量分数的增加，存活率均逐渐下降，这是由于当环境渗透压增大时，细胞中的K+和Na+含量不足，细胞失水无法维持正常平衡，当水分活度降低到一定程度导致死亡[20]；而在较低NaCl质量分数下仍能维持较高的存活率可能因为调节因子如分子伴侣（GroEL、GroES、DnaK、DnaJ等），在面对环境胁迫时，通过调节蛋白质的修复和折叠，以及甘氨酸甜菜碱等相似相容性物质，取代水与生物大分子物质结合，减少细胞失水，从而对细菌自身起到良好的保护作用[21]。

LuxS/AI-2 QS可以调控乳酸菌的多种代谢活动，luxS是合成AI-2信号分子中重要酶的编码基因，在调控中起着重要作用。当luxS基因缺失时，L. plantarum KLDS1.0391对NaCl的耐受能力及NaCl胁迫下的生长能力均较野生株显著下降，表明luxS基因对NaCl胁迫抗性起重要作用。Gu Yue等[22]研究表明当Lactobacillus fermentum 2-1在4.5% NaCl胁迫下生长时，luxS基因及pfs基因的表达量分别上调4.2 倍和2.9 倍，表明luxS基因在面对NaCl胁迫时起到一定的积极调节作用；此外Lin Lin等[23]也通过研究表明当luxS基因被破坏后，会抑制调节因子dps-1基因的表达，致使菌体无法抵抗环境压力；同样Van Kessel等[24]发现AI-2 QS系统参与了哈氏弧菌的渗透胁迫反应系统，且渗透耐受系统甘氨酸甜菜碱操纵子betIBA-proXWV由群体信号诱导，因此与野生型相比，信号调节基因luxR缺陷型菌株抗性较弱。然而Park等[25]研究虽然也证明了LuxS/AI-2 QS信号对Escherichia coli O157：H7应对渗透胁迫有一定作用，但是其结果表明在0.6 mol/L NaCl胁迫条件下，luxS缺陷型大肠杆菌生长速率快于野生株，且对渗透胁迫耐受性强，这可能是由于luxS基因的缺失影响大肠杆菌全局转录调控，改变了甲硫氨酸生物合成途径；同时rcsA可以激活多糖的合成，且该基因与sdiA（一种编码AHLs QS调节因子LuxR的同源物质基因）的表达相关，因此推测rcsA基因的表达差异可能是影响二者生理反应的主要原因。近年来，关于luxS/AI-2 QS参与应激反应[26]的研究逐步增加，Lebeer等[27]研究表明Lactobacillus rhamnosus的luxS突变株在模拟胃液中的存活率下降，表明luxS基因对胃酸应激起关键作用；L. acidophilus的luxS突变株由于无法产生AI-2信号分子，使得生物膜的合成能力受到严重影响，且对肠上皮细胞的黏附性仅为野生株的42%[28]。

细菌素是由核糖体合成的具有生物活性的蛋白质或多肽，可以抑制某些同源微生物的生长，可作为新型防腐剂或抑菌物质。野生株在2% NaCl质量分数下培养至稳定期后细菌素活性较对照组显著提高，而其他质量分数时细菌素活性则显著降低，这与Lim[29]的结论相似，L. plantarum KC21在低浓度NaCl胁迫下对细菌素合成有一定促进作用。然而当面对环境中的NaCl胁迫时，不同菌株也有差异，如Lactobacillus casei CTC494在有NaCl胁迫的条件下细菌素活性均下降[30]；而Lactobacillus pentosus B96在8%质量浓度NaCl胁迫时细菌素活性仍较正常培养时有所升高[31]。但对于相关机制目前尚未有明确定论，这可能由于适量NaCl可以改变细胞膜的通透性[32]，有利于细菌素的释放；同时细菌素的分泌有多种途径如Sec途径、SRP途径以及ABC转运系统等，一定浓度NaCl胁迫下可能使得相关基因的表达量发生改变[33]，增加了细胞分泌的效率，使得合成的细菌素更快的排出胞内被检测到相关活性。Man等[18]研究结果显示，L. plantarum KLDS1.0391中含有一对组氨酸蛋白激酶plNC8HK与相应调节因子plnD，并构建了plNC8HK-plnD基因突变株，发现突变株在单独培养时无细菌素活性检出，这表明该双组分系统对细菌素的合成具有重要的调控作用。本研究结果表明luxS基因缺失突变株在各NaCl质量分数胁迫下细菌素活性低于野生株，说明luxS基因显著影响细菌素的合成，且进一步实时荧光定量结果表明，突变株中与细菌素合成相关基因plnD、plnEF及plNC8HK基因的表达量均低于野生株。Merritt等[34]研究发现luxS基因缺失使得Streptococcus突变株无法产生细菌素mutacin I，且编码基因mutA的表达量也较野生株下调400多倍，位于操纵子下游基因的正调控基因mutR的表达量也显著下调，同样表明luxS基因对细菌素合成有重要意义。

细菌素作为生物防腐剂使用时，应具备在盐胁迫条件下有较好的生长与细菌素合成能力。本研究表明：L. plantarum KLDS1.0391野生株具有较好的盐耐受能力，在8% NaCl质量分数胁迫下仍能保持80%以上的存活率，且在低质量分数NaCl存在时可以显著提高细菌素合成能力；当luxS基因缺失时，其对高质量分数NaCl的耐受能力显著降低，且在任一NaCl质量分数胁迫下突变株的生长能力、细菌素合成能力均弱于野生株，细菌素合成相关基因的表达量也均显著下降，说明L. plantarum KLDS1.0391中的luxS基因参与盐胁迫响应且起着重要作用，这为胁迫下QS调控细菌素合成提供一定理论依据，同时为该菌株应用于实际生产提供理论支持。