HPLC-MS/MS测定生乳中L-羟脯氨酸的不确定度评定

康 宁 郭丽丽 刘晓琳 花 锦 高利珍

(1.太原理工大学，山西 太原 030024；2.中华人民共和国太原海关，山西 太原 030024；3.山西中医药大学，山西 晋中 030619)

在2008年爆发的三聚氰胺事件后，不少不法商贩又将目光转向动物水解蛋白，代替三聚氰胺加入到乳及乳制品中以增加乳中蛋白含量。L-羟脯氨酸是动物水解蛋白的特征成分[1]，乳蛋白质中不含有，它是胶原蛋白中特有的一种氨基酸，约占胶原蛋白氨基酸总量的10%，而胶原蛋白的主要来源是动物皮料。曾有无良商家向乳制品中掺杂以皮革下脚料等原料制备低廉的高蛋白产品，由于此类低廉的高蛋白产品存在铬残留，长期食用此类低廉高蛋白产品的乳制品会危害人体健康[2-3]。2011年中国食品安全整顿工作办公室发布关于印发《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第五批)》的通知(整顿办函〔2011〕1号)中明确皮革水解物不能加入乳制品中[4]。

目前，乳及乳制品中L-羟脯氨酸主要是采用分光光度法和液相色谱及质谱法来检测[4-6]，经检索对于各类食品检测方法的不确定度研究报告较多[7-9]，而L-羟脯氨酸的不确定度评估却较少[10-11]，尤其是L-羟脯氨酸在乳及乳制品中检测方法的不确定度评估，只有1篇关于分光光度法的不确定度研究[12]，对于检测实验室，检测质量的保证是很关键的，其次作为第三方检测机构在日常检测过程中，发现乳及乳制品中L-羟脯氨酸检测送检率较高，因此对于L-羟脯氨酸的质谱检测方法的不确定度亟待评估。

基于SN/T 3929—2014《出口食品中L-羟脯氨酸的测定》，本研究对本实验室测定生乳中L-羟脯氨酸测量的不确定进行评定，以期为结果的准确性提供保证，为客户提供公平公正的检测结果。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

生乳：散装，委托送检样品；

L-羟脯氨酸标准品：纯度(99±1)%，上海古朵生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；

优级纯、正己烷、盐酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

甲酸铵：天津市科密欧化学试剂有限公司；

高效液相色谱串联质谱仪：Waters ACQUITY TQ Detector型，美国沃特世公司；

电子分析天平：Mettler ME204E型，瑞士梅特勒集团；

冷冻干燥机：Scientz-18N型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

漩涡混匀器：TALBOYS DIGITAL VRTX MXR 230V EURO型，美国Henry Troemner公司；

旋转蒸发仪：Heating Bath B-491型，瑞士步琪(Buchi)实验室仪器公司；

超声波清洗器：KQ-500DB型，江苏省昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确移取L-羟脯氨酸标准品10 mg 于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1 mg/mL的标准溶液。吸取上述1 mLL-羟脯氨酸标准溶液，用水定容到10 mL容量瓶中，制成100 μg/mL标准中间溶液于4 ℃下保存。再移取0.003，0.005，0.010，0.020，0.050 mLL-羟脯氨酸标准中间溶液分别置于10 mL容量瓶中，再用水定容成标准工作溶液。

1.2.2 样品制备 准确称取生乳1 g于30 mL水解管中，移取6 mol/L盐酸溶液10 mL，混合后充入氮气封口，在105 ℃下水解过夜。将水解液冷却过滤，并用25 mL 水稀释后-80 ℃冷冻干燥2 h，冻干物依次加1 mL 水，10 mL 乙腈，溶解。将提取液40 ℃进行减压浓缩干，并用1 mL乙腈—水(9+1体积比)溶解。溶解液用5 mL乙腈饱和正己烷液液分配、萃取脱脂，下层溶液经 0.22 μm 滤膜过滤，待上机。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent HILIC(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱温：35 ℃；流动相：0.01 mol/L的甲酸铵溶液和乙腈；流速：0.4 mL/min；进样体积：10 μL。

1.2.4 羟脯氨酸测量的数学模型

(1)

式中：

X——样品中L-羟脯氨酸的含量，μg/kg；

c——溶液中L-羟脯氨酸在标准曲线中的浓度，ng/mL；

V1——提取液的体积，mL；

V2——用于净化样品的体积，mL；

V3——样品的最终定容体积，mL；

1 000——换算系数；

m——样品的质量，g；

f(rec)——回收率的校正因子；

f(rep)——重复性的校正因子。

2 分析过程中不确定度的分量

通过提取、净化、浓缩、定容生乳中的L-羟脯氨酸等步骤，液相色谱串联质谱法进行检测，各个环节都会引入不确定度。每个步骤对应的不确定度较为困难，本文选择评价了检测方法中数据的分量。

图1 生乳中L-羟脯氨酸测定不确定度来源图Figure 1 Uncertainty sources of determination for L-hydroxyproline in raw milk

2.1 质量引入的不确定度

称取样品0.518 5 g，由电子天平的计量证书获得，称量范围为0～100 g，示值误差为±0.000 1 g，取矩形分布，称量引入的标准不确定度为：

2.2 样品前处理中体积引入的不确定度

2.2.1 水解溶液定容体积引入的标准不确定度 JJG 196-2006《常用玻璃量器》检定规程中规定A级10 mL具塞比色管的容量允差为±0.002 0 mL，取矩形分布，则得出10 mL具塞比色管引入的标准不确定度为：

2.2.2 水解溶液分取体积引入的标准不确定度 2.5 mL分取体积需使用5 000 μL的移液器，JJG 646-2006《移液器》检定规程中规定：5 000 μL移液器取2 500 μL时的容量允差为±0.5%，取矩形分布，则得出水解液分取体积引入的不确定度为：

2.2.3 最终定容体积引入的标准不确定度 本方法定容体积为1 mL，JJG 646-2006《移液器》检定规程中规定：1 000 μL 移液器的容量允差为±1.0%，取矩形分布，则得出最终定容体积引入的不确定度为：

由前处理中体积引入的不确定度为：

2.3 标准工作溶液配制过程的不确定度

2.3.1 标准物质的不确定度L-羟脯氨酸标准物质证书上标出标准物质的不确定度urel(P)=0.000 25。

2.3.2 标准工作液配制过程的不确定度 使用0.1 mg 的分量天平、A级10 mL的容量瓶称取标准品、配制和稀释，JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》中规定A级10 mL容量瓶最大允许差为±0.025 mL，因此由容量瓶引入的不确定度为：

2.3.3L-羟脯氨酸标准曲线引入的不确定度 配制质量浓度为30，50，100，200，500 ng/mL的校准标准溶液，计算得到的标准曲线的不确定度只与仪器的灵敏度相关。L-羟脯氨酸标准曲线图见图2。

根据式(2)、(3)计算L-羟脯氨酸标准曲线引入的不确定度。

图2 L-羟脯氨酸标准曲线图Figure 2 L-hydroxyproline standard curve

(2)

(3)

式中：

urel(C)——L-羟脯氨酸标准曲线引入的不确定度；

SA——回归直线标准偏差；

Ai——i个质量浓度点测定的峰面积；

R——按回归方程计算得出的i点的峰面积；

N——标准溶液浓度点。

经计算得urel(C)=0.053 6。

2.3.4 标准工作液浓度不确定度的合成

2.4 回收率带入的不确定度

对空白样品进行加标回收试验，需要添加6次相同浓度的标样，测得回收率分别为94.3%，98.1%，97.8%，92.7%，99.9%，99.2%，平均回收率97.0%，根据式(4)、(5)计算回收率引入的相对标准不确定度。

(4)

(5)

式中：

urel(frec)——回收率引入的不确定度；

n——回收率测定的频次点。

2.5 重复性带入的不确定度

选取一个阳性样品进行重复性试验(n=6)，L-羟脯氨酸测得结果为374.351 2，375.463 5，375.631 3，375.785 6，374.379 9，375.129 5 μg/kg，平均值为375.123 5 μg/kg，根据式(4)、(5)计算重复性引入的相对标准不确度：urel(frep)=0.033 83。

2.6 合成最终的不确定度

通过对方法重复性及数学模型的每个分量引入的不确定度等分量进行合成，最终通过计算合成不确定度：

urel(X)=

0.068 7 μg/kg。

2.7 扩展不确定度

置信概率约为95%，取包含因子k=2，高效液相色谱串联质谱法检测生乳中L-羟脯氨酸的相对扩展不确定度为：urel=k×urel(X)=2×0.068 7=0.137 4 μg/kg。

3 测量结果及其不确定度的报告

用高效液相色谱串联质谱法测定生乳中L-羟脯氨酸含量，测定结果可表示为：X=(375.123 5±0.137 4)μg/kg，k=2。

4 结论

高效液相色谱串联质谱法检测生乳中L-羟脯氨酸过程中的不确定度，主要来源于前处理的过程、天平的称量过程、标准溶液的配制过程及浓度、回收率、重复性5个分量。对这5个分量进行不确定度评定，最终得出扩展不确定度为0.137 4 μg/kg，当包含因子k=2、生乳中L-羟脯氨酸检测值为375.123 5 μg/kg时，测定结果可表示为：(375.123 5±0.137 4)μg/kg，k=2(置信概率约为95%)。

检测结果的不确定度主要来源于最小二乘法拟合的标准曲线、重复性及回收率，因此，可以采取增加标准曲线的进样次数、增加平行样品的测试，选择精度更高的器皿来代替普通的器皿，优化前处理过程等措施来减少各不确定度分量对检测结果的影响，增加检测结果的可信度。