核桃粕中环烯醚萜苷提取分离与抗疲劳活性研究

金 蒙 徐德平 詹 积 陈 晨

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

核桃(JuglansregiaL)又名胡桃、羌桃、合桃等，系胡桃科植物胡桃的干燥果实[1]，含蛋白质、碳水化合物、脂肪等多种成分[2-3]。现代医学研究[4-8]表明，核桃具有健脑益智、降血脂、抗氧化、降血糖、补肾固精、抗疲劳等多种功效。

核桃粕是核桃榨油后的饼粕，富含蛋白质、维生素等营养物质，大多用作饲料，仅少量用于生产核桃蛋白粉等初级产品，造成资源浪费[9]。樊永波等[10]研究表明，影响大鼠学习、记忆和抗氧化功能的主要成分存在于核桃粕中。乌兰等[11]发现核桃粕中的核桃肽可提高乳酸脱氢酶活性，降低血乳酸和血清尿素氮含量，提高肌糖原储备量，显著延长负重游泳时间，具备一定的缓解疲劳的作用。可见对核桃粕功能成分及作用机制的研究十分必要。而目前，中国对核桃的研究主要集中在对核桃油脂的营养价值以及对核桃蛋白的提取工艺方面，对核桃粕功能的研究报道较少，且均为对核桃粕粗提取物的功能研究，有关核桃粕中的功能成分，特别是抗疲劳活性成分目前尚未明确。

本试验对核桃冷榨粕进行提取分离，拟对核桃提取物的不同萃取物进行抗疲劳作用研究，以确定核桃粕中对补肾固精、抗疲劳的有效成分，以期为核桃粕研究和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

核桃冷榨粕：云南林科院；

无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

ICR小白鼠：雄性，上海斯莱克实验动物有限公司。

1.1.2 仪器与设备

不锈钢五谷杂粮磨粉机：CLF-250型，浙江省温岭市创立药材器械厂；

双层玻璃提取罐：RAT-100型，无锡申科仪器有限公司；

旋转蒸发器：R1005型，上海申顺生物科技有限公司；

循环水式多用真空泵：SHZ-95型，上海丞明仪器设备有限公司；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技术公司；

电脑全自动部份收集器：DBS-100型，上海沪西分析仪器厂有限公司；

超声波清洗器：KQ-250B型，昆山市超声仪器有限公司；

动物实验跑台：BW-TDW709型，上海软隆科技发展有限公司；

核磁共振仪：Avance 500 MHz，德国Bruker公司；

高压液相仪：Waters Alliance 1525分离单元，美国Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃粕提取物与粗分离 称取核桃粕10 kg，粉碎后过30目筛，置于100 L提取罐中，按1∶10(g/mL)料液比加入体积分数为75%乙醇，60 ℃条件下搅拌提取5 h，过滤取滤液，滤渣重复提取两次，合并滤液，减压浓缩至2 L，即为核桃粕乙醇提取物A，保存备用。向核桃粕醇提后的滤渣中加入100 L去离子水，并于60 ℃条件下搅拌提取5 h，过滤，取上清液减压浓缩至合适体积，即为核桃粕水提物，-18 ℃下保存备用。

取适量核桃粕乙醇提取物于1 000 mL分液漏斗中，按1∶1体积比加入乙酸乙酯，震荡混匀静置，反复萃取3次，取乙酸乙酯相浓缩至浸膏状，即得乙酸乙酯萃取物B，在乙酸乙酯萃取残余物中再按1∶1体积比加入正丁醇，震荡混匀静置，萃取3次，取正丁醇相减压浓缩至浸膏状，即得正丁醇萃取物C，低温保存备用。取适量核桃粕水提物，加入适量无水乙醇至酒精浓度达到70%以上，并且不断搅拌使得浓缩液充分醇沉，静置过夜，过滤，滤液相经减压浓缩至浸膏，得水提醇溶物D，低温保存备用。

1.2.2 核桃粕不同组分的抗疲劳作用 取3周龄 SPF级雄性ICR小白鼠50只，体重(16.0±2.0)g。适应性喂养1周后，随机分为空白组与A、B、C、D试验组，每组10只。用水溶解各提取物，并对试验组每日给以剂量1.0 g/kg灌胃，小鼠的灌胃体积为0.1 mL/10 g，空白组给等量正常饮用水，连续给药30 d。

(1)小鼠跑台试验：给药前1周，在喂食30 min后对小鼠进行15 min跑步机适应性训练；连续给药，第30天给药后30 min，对小鼠进行体能测试。小鼠训练和测试方法如表1，通过逐渐加大速度和坡度的测试方案，最后以20 m/min速度使小鼠奔跑直至力竭。若小鼠落入电击区，数次电击后仍无法继续活动即判定力竭，记录跑步时间。测试过程中，小鼠若因受电击离开刺激源，在跑带上继续活动，此时通道计时累加。用时到达2 h后，试验结束。

表1 试验动物训练及测试方案†Table 1 Training and measurement plan of laboratory animals

† 10 min之后保持20 m/min速度和10°坡度至结束。

(2)小鼠负重游泳试验：根据文献[12-13]修改如下：跑台试验测试结束24 h后，再次给药，30 min后对小鼠进行负重游泳试验。将小鼠放入水深 35 cm，水温(25±1)℃的水箱(50 cm×50 cm×50 cm)，鼠尾负5%体重的铅皮，记录小鼠放入水箱至水浸没头部后持续8 s不能浮出水面的时间，即力竭时间。

1.2.3 核桃粕抗疲劳作用组分的分析 利用HPLC对具有抗疲劳作用的萃取物中化学组成进行分析。色谱条件：色谱柱XBridgeTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈—水溶液(40∶60)；流速1 mL/min；进样量20 μL。紫外检测器条件203 nm。

1.2.4 抗疲劳活性组分的分离 将具有抗疲劳活性组分的正丁醇萃取物C取出解冻，过滤，上样到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用去离子水、体积分数为5%，10%，50%的乙醇进行梯度洗脱，流速10 mL/min，用TLC薄层法跟踪检测洗脱液中的成分，并根据Rf值和显色反应的结果，分析合并相同组分，得到水洗脱物L、5%乙醇洗脱物M和10%乙醇洗脱物N。

1.2.5 抗疲劳活性化合物的化学鉴定 将得到的抗疲劳活性化合物以氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标物，进行1H NMR、13C NMR等测定。

1.2.6 单体化合物的抗疲劳作用 取3周龄SPF级雄性ICR小白鼠20只，体重(16.0±2.0)g。适应性喂养1周后，随机分为空白组与试验组，每组10只。试验组给单体化合物Ⅱ以每日剂量0.5 g/kg灌胃，小鼠的灌胃体积为0.1 mL/10 g 只，空白组给等量正常饮用水，连续给药21 d 后，记录小鼠体重变化，并进行小鼠跑台试验和负重游泳试验，方法同1.2.2。

2 结果与分析

2.1 核桃粕不同组分的抗疲劳作用

由表2可知，各试验组中，核桃粕正丁醇萃取物组C小鼠体重变化最大，跑台测试力竭时间和负重游泳力竭时间均为最佳，抗疲劳效果最显著，且与对照小鼠存在显著性差异(P<0.01)。而A、B、D组小鼠的体重变化、跑台测试力竭时间和负重游泳力竭时间与空白组相比均无明显改善，说明不含抗疲劳活性成分。由此推断核桃粕醇提物有抗疲劳作用，且有效成分分布于核桃粕醇提物正丁醇萃取物中，故对正丁醇萃取物进一步分离。

表2不同萃取物对小鼠体重、跑台测试和负重游泳的影响†
Table 2Effects of different extracts on body weight,treadmill test and weight-bearing swimming of mice(n=10)

组别体重变化/g跑台测试力竭时间/s负重游泳力竭时间/s对照12.16±14.0673±22.3835±1.89A组16.41±13.14∗92±18.33∗52±2.95B组13.37±12.3380±22.4244±2.56C组18.46±11.37∗98±21.46∗59±2.35D组12.77±11.5779±16.7841±2.66

† * 表示与对照组比较P<0.05。

2.2 正丁醇萃取物组成成分

核桃粕抗疲劳有效成分存在于乙醇提取物正丁醇萃取物中，对该萃取物进行HPLC分析，图1为正丁醇萃取物的HPLC图谱，图中主要由4个峰，保留时间分别为2.008，2.949，3.508，4.405 min，说明该部分主要由4种化合物组成。

2.3 抗疲劳作用单体化合物的分离及鉴定

2.3.1 化合物的分离 保留时间为2.008 min 的化合物由于含量较低，未能分离到单体。其他组分分离结果：

(1)水洗脱物L：将L反复上ODS-AQ柱(3 cm×100 cm)，用去离子水洗脱，流速10 mL/min，洗脱液用试管收集，TLC法跟踪检测洗脱液中的成分，并根据Rf值和显色反应的结果，分析合并相同组分，得到单体化合物Ⅰ，即为图1中保留值为2.949 min的化合物。

图1 正丁醇萃取物液相色谱图
Figure 1 HPLC ofN-butanol extract

(2)5%乙醇洗脱物M：将M反复上ODS-AQ柱(3 cm×100 cm)，依次用体积分数2%，5%，10%，15%的乙醇溶剂洗脱，流速10 mL/min，自动收集器每管20 mL收集洗脱液，用TLC法检测其中成分，并据Rf值和显色反应情况合并相同组分，直至得到单体化合物Ⅱ，即为图1 中保留值为3.508 min的化合物。

(3)10%乙醇洗脱物N：将N反复上ODS-A柱(3 cm×100 cm)，用体积分数5%，10%，20%，50%的乙醇溶剂洗脱，流速8 mL/min，洗脱液用试管收集，TLC法检测其成分，并根据结果将相同组分合并，直至得到单体化合物Ⅲ，即为图1中保留值为4.405 min的化合物。

2.3.2 结构鉴定 有抗疲劳活性组分的正丁醇萃取物经ODS-AQ、ODS-A柱层析分离得到3个化合物，经 TLC法显色可见化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的单一斑点，均为单一化合物，其化学结构分别为：

(1)化合物Ⅰ：无定形粉沫，易溶于水，微溶于乙醇、甲醇。

从1H-NMR(500 MHz，D2O)可见：δ4.61(1H，d，J=1.2)应为糖上的端基H-1信号，δ3.3～3.8为糖上的其余H信号，δ1.09有1个三峰甲基信号，表明化合物为糖的衍生物；从13C-NMR可见：δ103.5，76.7，74.0，72.1，70.5，61.8，61.3，15.3共8个碳信号，经文献[14]对比，该化合物为α-乙氧基半乳糖苷。

(2)化合物Ⅱ：无定形粉沫，易溶于水、乙醇、甲醇。其1H-NMR(500 MHz，D2O)和13C-NMR图谱见图2，由图谱可见其无杂峰，为单一化合物。

从图2(a)可见：δ7.2(1H，s)；δ5.9(1H，s)；δ5.5(1H，s)；δ5.4(1H，d，J=6.0)；δ4.3(2H，dd，J=19.5,43.5)；δ3.9(1H，d，J=15.5)；δ3.7(1H，dd，J=7.0,15.5)；δ3.5(3H，m)；δ3.3(2H，m)；δ3.2(1H，t，J=6.0)。

综合分析并与文献[15]对比，该化合物为环戊烯型环烯醚萜苷类化合物，结构为：4-羧基-7-羟基-8-乙酸乙酯基-3,6-环戊烯环烯醚萜苷，为首次从核桃粕中分离出的物质，化学结构如图3所示。

(3)化合物Ⅲ：白色无定形粉沫，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇。从1H-NMR(500 MHz，D2O)可见：6.41(1H，d，J=8.0)，6.31(1H，d，J=8.0)，6.29(1H，d，J=8.0)；从13C-NMR 可见：δ146.6，133.4，118.9，107.6共4个碳信号，经文献[14]对比，该化合物为尿嘧啶。

图2 化合物Ⅱ的1H-NMR和13C-NMR图谱Figure 2 1H-NMR and 13C-NMR of Ⅱ

图3 化合物Ⅱ的化学结构Figure 3 The chemical structures of compounds Ⅱ

2.4 单体化合物的抗疲劳作用

化合物Ⅰ、Ⅲ未有文献报道其具抗疲劳活性，而化合物Ⅱ为环烯醚萜苷类化合物，此前多有研究[16]报道该化合物具有抗疲劳活性，因此对化合物Ⅱ单体进行抗疲劳评价，其作用如表3所示。

由表3可知，单体化合物Ⅱ组小鼠的体重显著增加(P<0.05)，跑台测试力竭时间和负重游泳力竭时间最长，分别为(111±30.44)s和(56±4.87)s，明显高于对照组(P<0.01)，由此推断，单体化合物Ⅱ，即4-羧基-7-羟基-8-乙酸乙酯基-3,6-环戊烯环烯醚萜苷，为核桃抗疲劳的活性成分之一。

表3化合物Ⅱ对小鼠体重、跑台测试和负重游泳的影响†
Table 3Effect of compound II on body weight,treadmill test and weight-bearing swimming of mice(n=10)

组别体重变化/g跑台测试力竭时间/s负重游泳力竭时间/s对照组11.22±12.1978±28.2829±3.67化合物Ⅱ组18.94±14.77∗111±30.44∗∗56±4.87∗∗

† 与空白对照组比较，* 表示P<0.05；**表示 P<0.01。

3 结论

本研究通过小鼠跑台试验和负重游泳试验，发现正丁醇组小鼠的抗疲劳能力明显高于乙醇提取组、乙酸乙酯组和乙醇萃取组，说明核桃粕醇提物正丁醇萃取物含有具明显抗疲劳作用的成分。正丁醇萃取物经MCI柱和ODS柱分离得到的3个主要化合物，经鉴定分别为α-乙氧基半乳糖苷、4-羧基-7-羟基-8-乙酸乙酯基-3,6-环戊烯环烯醚萜苷和尿嘧啶。

本文从核桃中分离到环烯醚萜苷类成分，并经动物试验表明该成分具有显著抗疲劳功效，与核桃补肾固精、抗疲劳作用有关。但核桃粕中是否还存在环烯醚萜苷类类似物或其他补肾固精、抗疲劳功效成分还仍需进一步研究明确。