宫颈鳞状细胞癌中MUC4、EGFR和p-AKT的表达及意义

李王丽 佟 晓 陈 斌

宫颈鳞状细胞癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，高发年龄在50岁左右，近年来其发病有年轻化的趋势[1-2]。宫颈鳞状细胞癌的具体发病机制还不明确，病因包括遗传、长期雌激素刺激、体质因素等[3]。现代研究表明宫颈鳞状细胞癌的发生与发展是涉及多个遗传变化多阶段演化过程，其中癌症相关基因的检测有助于宫颈鳞状细胞癌的诊断、预后和预测[4-5]。黏蛋白4(mucin 4,MUC4)是一种高分子量的糖基化蛋白，在正常的女性生殖道中均有表达，在宫颈癌中MUC4的表达量较正常的宫颈组织显著上升[6-7]。内皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)也是一种酪氨酸激酶受体，可参与体内的多种反应，EGFR及其相关的信号通路可以作为宫颈癌患者的治疗靶点[8]；其也能够进一步激活该通路的下游因子从而促进肿瘤细胞的生长、增殖，侵袭和转移，抑制肿瘤细胞凋亡[9-10]。本文采用免疫组织化学技术检测MUC4、EGFR和p-AKT在宫颈鳞状细胞癌组织与癌旁组织中的表达，探讨其在宫颈鳞状细胞癌发生与发展中的意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

采用回顾性、总结研究方法，2015年9月到2017年12月选择在我院进行手术诊治的宫颈鳞状细胞癌患者120例的癌组织标本与癌旁组织标本作为研究对象，纳入标准：术前未接受放疗、化疗及激素治疗；有完整的临床与病理资料；病理检查诊断为宫颈鳞状细胞癌；癌旁组织与离癌组织距离≥3 cm；医院伦理委员会批准了此次研究。排除标准：伴随有妇科内分泌疾病及生殖道炎症；妊娠与哺乳期妇女；临床与病理资料缺项。

在120例患者的组织标本中，年龄最小45岁，最大78岁，平均年龄(65.33±4.21)岁，年龄≥60岁60例；分化程度：高分化80例，中分化20例，低分化20例；临床分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期40例，Ⅲ期20例；淋巴结转移30例；肌层浸润50例。

1.2 免疫组化方法

所有患者的癌组织标本与癌旁组织标本取材后，用10%的甲醛溶液固定12～24 h，石蜡包埋，制备成4 μm厚的石蜡切片。

兔抗人MUC4、EGFR和p-AKT多克隆抗体来自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB酶底物显色剂来自广州深达生物制品技术有限公司，超敏链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶染色法(S-P免疫组化法)广谱免疫组化试剂盒来自广州深达生物制品技术有限公司。

将切片组织37 ℃烤24 h，脱蜡后清洗3次。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，清洗3次后进行抗原修复，加入一抗，湿盒内4 ℃过夜。清洗后，加二抗37 ℃，30 min。DAB显色，脱水封片后在光学显微镜观察。取已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 观察指标

镜下顺序放大200倍，每张切片随机选取10个视野。MUC4、EGFR和p-AKT蛋白表达阳性为胞质或胞核内出现棕黄色颗粒。染色强度阴性为0分、染色弱但强于阴性对照为1分、染色清晰为2分、染色强为3分。阳性细胞数<10%为0分，≥10%～30%为1分，>30%～60%为2分，>60%为3分。上述二种评分相加0～1分为(-)，2分为(+)，3～4分为(++)，5～6分为(+++)，3～6分为阳性表达。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 MUC4、EGFR和p-AKT表达阳性率情况

癌组织中MUC4、EGFR和p-AKT表达阳性率分别为90.8%、74.2%和93.3%，癌旁组织分别为28.3%、36.7%和30.0%，对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同组织的MUC4、EGFR和p-AKT阳性表达情况(例，%)

2.2 MUC4、EGFR和p-AKT表达与临床病理特征参数的相关性

在宫颈鳞状细胞癌组织中，MUC4、EGFR和p-AKT表达阳性率随着分化程度的降低、临床分期的增加、肌层浸润深度的加深、淋巴结的转移而显著增高(P<0.05)。见表2。

2.3 MUC4、EGFR和p-AKT的相关性分析

在宫颈鳞状细胞癌组织中，Spearman等级相关分析显示MUC4与EGFR呈显著正相关性(γ=0.563，P<0.05),MUC4与p-AKT呈显著正相关性(γ=0.433，P<0.05)，EGFR与p-AKT呈显著正相关性(γ=0.411，P<0.05)。见表3。

3 讨论

宫颈鳞状细胞癌是严重危害女性健康的疾病，当前在我国的发病率有上升趋势，已对女性的生命和健康造成了严重的威胁[11]。已有研究发现宫颈鳞状细胞癌患者存在血糖异常，多伴随有肥胖、高血压、糖尿病等基础疾病，其发生与发展是一个相对复杂的过程，也是多种因素综合作用导致的病变[12-13]。

本研究显示癌组织中MUC4、EGFR和p-AKT表达阳性率分别为90.8%、74.2%和93.3%，癌旁组织分别为28.3%、36.7%和30.0%，对比差异有统计学意义(P<0.05)。MUC4对上皮细胞的完整性和更新起着重要作用，其在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤中均表达异常[14]，但其具体机制目前尚不清楚。EGFR在多种实性肿瘤中表现出高度活性，在宫颈鳞状细胞癌的患者体内出现了EGFR基因扩增、表达上调。EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，其前体在胞质内质网中经修饰形成成熟EGFR，膜受体与配体结合形成受体复合物，经内陷、吞饮进入胞质，于溶酶体内降解，受体再循环至膜上[15-16]。研究表明，约80%的宫颈癌、50%的卵巢癌、60%的子宫内膜癌、70%的外阴癌组织中存在EGFR的过度表达，远高于正常组织，其中以宫颈、外阴的鳞状上皮肿瘤中过表达最明显[17]。Akt经磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-3-磷脂酰肌醇依赖性激酶-1(PDK1)，整合素连接激酶等作用后发生2个位点的磷酸化，从而被激活，p-Akt为其活化形式，在胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、卵巢癌、甲状腺癌都呈现高表达状况[18]。

表2 MUC4、EGFR和p-AKT阳性表达与临床病理特征参数的相关性(例，%)

表3 宫颈鳞状细胞癌组织MUC4、EGFR和p-AKT表达的相关性分析(n=120)

宫颈鳞状细胞癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，组织学上为高分化、中分化、低分化，高发年龄为55岁左右，近年来其发病有年轻化的趋势。本研究显示在宫颈鳞状细胞癌组织中，MUC4、EGFR和p-AKT表达阳性率随着分化程度的降低、临床分期的增加、肌层浸润深度的加深、淋巴结的转移而显著增高(P<0.05)。MUC4包括2个EGF样结构域、1个跨膜区及1个磷酸化位点，MUC4高表达与结肠癌、胆管细胞癌、胰腺癌患者的预后呈负相关[19]。EGFR是生长因子受体，主要参与肿瘤细胞的增殖，目前已经作为一些恶性肿瘤的诊断指标应用于临床[20]。EGFR表达增加与宫颈癌的恶性度及不良预后相关，EGFR中强表达与临床分期、肿瘤体积、淋巴结转移等临床病理因素相关。宫颈癌中p-AKT受到多种信号分子的影响，与酪氨酸激酶受体如EGFR、FGFR、PDGFR等结合后通过PI3K/AKT信号通路激活细胞的生长和存活[21]。本研究Spearman等级相关分析显示宫颈鳞状细胞癌组织的MUC4与EGFR、p-AKT呈显著正相关性(P<0.05)，EGFR与p-AKT呈显著正相关性(P<0.05)。有研究显示在宫颈鳞状细胞癌中存在EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活，可促进肿瘤的发生发展，其中PI3K/AKT信号通路主要参与调控细胞的存活[22]。MUC4可以调控EGFR的表达，从而促进肿瘤细胞的转移和侵袭能力。EGF和TGF-α可以与胞内酪氨酸激酶受体结合后激活其下游的信号通路，从而促进MUC4的转录[23]。不过本研究也有一定的不足，与样本量偏小有关，而且免疫组织化学染色主要是在蛋白水平检测，可能存在一定的检测误差，将在下一步中完善分析。

综上所述，MUC4、EGFR和p-AKT在宫颈鳞状细胞癌中呈现高表达，与临床病理特征参数密切相关，共同参与调节宫颈鳞状细胞癌的发生与发展。