稳定表达人源GRM4基因的乳腺癌细胞株的筛选及鉴定

林志坚 肖 斌 孙朝晖 李林海

根据2017 年发布的中国肿瘤登记年报显示，乳腺癌的发病率已经高居全球女性恶性肿瘤之首，发病率高达28.42/10 万，每年新发病例约27.9 万，死亡病例数约6.5 万[1]。

谷氨酸是重要的兴奋性神经递质之一，谷氨酸通过与谷氨酸受体结合发挥生物学作用[2]。谷氨酸受体分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体两类。代谢型谷氨酸受体包括GRM1-8共8个受体亚型，为G蛋白偶联受体家族成员，通过介导第二信使来调节受体生理功能[3]。

代谢型谷氨酸受体4 (Glutamate Metabotropic Receptor 4，GRM4)是1种突触前谷氨酸受体，其在控制运动的基底神经节环路的数个关键位置表达[4]，参与突触前兴奋性谷氨酸信号的神经传递。研究表明GRM4在结直肠癌[5]、骨肉瘤[6]等多种肿瘤中高表达并与肿瘤患者的预后相关，其过表达可能是导致恶性肿瘤发生发展的重要原因。而我们课题组近期也报道了GRM4与乳腺癌发生、发展中的生物学作用[7]。本研究拟构建人GRM4基因慢病毒载体，并筛选稳定表达GRM4蛋白的乳腺癌MDA-MB-231细胞株，为进一步探讨GRM4在乳腺癌中的生物学作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

非病毒质粒3×Flag-GRM4、293T细胞系、MDA-MB-231细胞、慢病毒载体质粒、包膜质粒pMD2.G及包装质粒psPAX2由本实验室保存；DNA maker购自Takara公司(Cat:3427Q)；总RNA提取试剂(Cat:ER101-01)及qPCR试剂(Cat:AQ141-01)购自北京全式金公司；LipofectamineTM 2000购自Thermo Fisher(Cat:11668027)；凝胶纯化试剂盒、TaqDNA聚合酶及dNTP、限制性内切酶购自Takara公司；ECL Western blotting试剂盒购自Thermo Fisher(Cat:WP20005)；DAPI染液购自碧云天(Cat:C1002)。

1.2 重组慢病毒GRM4质粒的构建和鉴定

1.2.1 目的片段获取 以之前构建好的非病毒质粒3×Flag-GRM4为模板，进行PCR扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶纯化后回收备用。

1.2.2 重组质粒的构建和鉴定 将PCR产物与慢病毒载体进行常规的连接、转化、挑菌等分子克隆实验，重组质粒并送华大基因测序鉴定。

1.3 GRM4慢病毒的包装

转染前一天在10 cm平皿中接种293T包装细胞，用10%FBS的DMEM培养基；包装细胞50%融合时共转染质粒pMD2.G、psPAX2以及慢病毒表达载体各4 μg，以及30 μl标准的脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000，同时设置慢病毒空载体pCDH-vector作为阴性对照；6 h后换液，加入10 ml的新鲜培养基；48 h后培养上清用0.45 μm的非硝酸纤维滤器消毒过滤，以清除细胞碎屑及污染的包装细胞，4 ℃暂时保存。

1.4 MDA-MB-231细胞感染、稳定株的与鉴定

感染前一天(18～24 h)，将目标细胞铺于10 cm平皿；细胞达到50%融合度后，将10 ml的含病毒上清液加入8 μg/ml的Polybrene(已配成1000×工作液)；6 h后更换正常培养基(含10%FBS的DMEM)；24 h后开始用浓度0.5 μg/ml puro筛选；每1～2天更换培养基(均含相同puro浓度，根据细胞死亡情况，调整puro浓度)；约1周后可挑选出稳定细胞株，获得的细胞即为稳定表达GRM4的细胞，在荧光显微镜下观察各孔中GFP的荧光表达情况；将筛选后的稳定表达GRM4细胞和对照细胞按5×10个/孔接种于6孔板完全培养基中，孵育24 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA，采用RT-PCR方法检测两组细胞中GRM4基因表达的情况。

1.5 Western blotting检测GRM4的表达

RIPA 裂解液提取细胞总蛋白质，按BCA蛋白质定量试剂盒说明书操作测定蛋白质浓度。蛋白质样品进行SDS-PAGE，电转印至PVDF膜后，用50 g/l脱脂牛奶37 ℃封闭1 h，加以50 g/L脱脂牛奶1∶1 000稀释的抗兔Flag抗体，4 ℃过夜，TBS-T洗膜后，加以50 g/l脱脂牛奶1∶2 000稀释的HRP标记羊抗兔抗体，37 ℃温育1 h，TBS-T洗膜，ECL液显影，β-actin作为内参蛋白定量。

2 结果

2.1 目的片段的获得

以非病毒质粒3×Flag-GRM4为模板PCR扩增获得目的基因DNA后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，可见大小约为2700 bp明亮特异的目的条带，与GRM4的分子量大小相符(2736 bp)(图1)。

图1 PCR扩增目的基因GRM4的电泳图

2.2 重组质粒的构建和鉴定

将重组慢病毒质粒送至华大公司测序验证，经序列比对后证实插入序列无误，表明重组慢病毒质粒构建成功。

2.3 重组GRM4慢病毒的包装

GRM4慢病毒载体表达质粒和慢病毒空载体质粒pCDH-vector与包装病毒系统质粒pMD2.G、psPAX2共同转染293T细胞，转染1周后收集病毒上清液。

2.4 MDA-MB-231细胞感染、稳定株的筛选及鉴定

在荧光显微镜下可观察到重组GRM4慢病毒感染后的细胞和对照细胞均带有绿色荧光，证明病毒成功感染细胞。进一步将感染过的细胞传代，于40×显微镜下可观察到转染的细胞生长情况与正常细胞相比，细胞形态基本一致，细胞数量明显增多，生长状况良好；证明转染细胞群培养成功。

2.5 RT-PCR法和Western blot法检测感染细胞中GRM4表达

实时荧光PCR检测结果显示重组慢病毒感染的细胞中GRM4基因mRNA表达水平明显高于对照组(图2A)。Western blot 检测结果表明，重组慢病毒感染的细胞中GRM4蛋白表达量明显高于对照组(图2B)。综上所述，稳定表达GRM4的MDA-MB-231细胞株构建成功。

A为RT-PCR法检测法，B为Western blot检测法。

3 讨论

代谢型谷氨酸受体是1个庞大的受体家族，它主要参与学习、记忆、疼痛的传导以及维持中枢神经系统细胞内环境的稳定。这些受体被激活后通过G-蛋白效应酶、脑内第二信使等组成的信号转导系统起作用，产生较缓慢的生理反应。有研究表明，谷氨酸信号通路的紊乱可能会导致肿瘤的发生[8]。最初，对于代谢型谷氨酸受体的研究大多集中在中枢神经系统方面。事实上，谷氨酸及其受体在外周组织中也有广泛分布[9]，越来越多的研究发现这些受体不仅参与神经突触的调控，还在细胞增殖、分化和生存方面发挥重要作用[10]。新近研究表明，GRM5在肝脏中具有表达，且在与肝脏相关的病理过程中发挥着重要的调节作用，GRM5的表达及活性升高可能是导致肝细胞癌变的重要原因[11]。

GRM4主要是突触前谷氨酸受体，其在控制运动的基底神经节环路的数个关键位置表达[4]，参与突触前兴奋性谷氨酸信号的神经传递。GRM4可在人的骨肉瘤细胞中表达[6,12]，并且骨肉瘤组织中GRM4的高表达与预后不良相关[13]。此外，GRM4已经被证明与许多肿瘤的预后不良相关，如结直肠癌[5]，横纹肌肉瘤和多发性骨髓瘤[14]。肖斌等人的研究发现GRM4能够促进乳腺癌细胞的增殖能力[7]。根据GRM4的前期研究报道及代谢型谷氨酸受体各亚型在多种肿瘤进程中的作用，我们推测GRM4可能在乳腺癌发生发展过程中发挥重要作用。

细胞基因转染有多种载体可供选择，如质粒、脂质体、反转录病毒和腺病毒等，其中慢病毒载体以其高感染率、高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广及安全性好等特点，已成为真核系统基因转移的有力工具。本研究通过基因重组技术将GRM4基因插入到慢病毒载体中，构建了重组慢病毒载体质粒。随后，将构建好的重组质粒与病毒包装质粒同时转染到239T细胞中，进行病毒包装。用重组慢病毒感染MDA-MB-231细胞，经药物筛选和实验鉴定后，成功获得稳定表达GRM4蛋白的细胞株。稳定表达GRM4蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株的获得，可作为GRM4 蛋白过表达载体应用于肿瘤等疾病的功能研究，有助于从细胞和分子水平深入探讨GRM4 蛋白在乳腺癌细胞的发生发展过程中的作用机制。