分子印迹聚合物固相萃取黄毛耳草中熊果酸

邢占芬，成洪达*，张平平，王清路

1. 齐鲁医药学院药学院（淄博 255213）；2. 齐鲁医药学院生物医学工程技术重点实验室（淄博 255213）

熊果酸为三萜类物质，是一种用途广泛的食品添加剂，同时熊果酸具有很强的生物活性，在临床上可用于癌症、高血脂、溃疡、糖尿病等疾病的治疗[11-13]。熊果酸来源很广，可以从多种植物中提取，如黄毛耳草、女贞子、冬凌草、车前草、枇杷叶等。

分子印迹技术具有锁钥结构特点，对预定分子有很高的选择性和卓越的识别性能，具有分离效率高、稳定性好、消耗溶剂少等特点[1-3]。基于其优良的性能，分子印迹技术已广泛用于天然药物有效成分分离、传感器分子识别、色谱层析固定相和药物传递等领域[4-7]。固相萃取技术是一项高效的分离富集技术，将分子印迹聚合物用作固相萃取填料，可有效将印迹技术的特异性吸附和固相萃取卓越的分离效率相结合，提高分离萃取能力[8-10]。

试验将通过红外光谱分析，制备熊果酸印迹聚合物，考察其特异性吸附能力，将印迹聚合物与固相萃取技术相结合用于黄毛耳草中熊果酸的分离与富集。

1 仪器、设备与试剂

傅里叶变换红外光谱仪（IR Prestige-21，日本岛津公司）、电子天平（FA 1004 N，上海精密科学仪器有限公司）、高效液相色谱仪（LC-20 A，日本岛津公司）、电热恒温水箱（CU 600，精慧智能仪表公司）、紫外可见分光光度计（UV 2550，日本岛津公司）、数控超声波清洗机（WTY 600，超声功率600 W，频率28 kHz，万通超声仪器设备厂）、台式恒温振荡仪（THZ-22，江苏太仓市实验设备厂）、固相萃取装置（57044，Supelco）。

黄毛耳草（安国市云天中药行）、熊果酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号Z110742）、丙烯酸（AC，上海谱振生物科技有限公司）、偶氮二异丁腈（AIBN，上海谱振生物科技有限公司）、4-乙烯基吡啶（4-VP，百灵威科技有限公司）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，百灵威科技有限公司）、丙烯酸（天津市兴复精细化工研究所）、四氢呋喃（天津市康科德科技有限公司）、甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为二次蒸馏水。

2 试验内容

2.1 聚合物的制备

精密称取0.01 g熊果酸于1.50 mL四氢呋喃中，超声使模板分子溶解，加入6.00 μL丙烯酸、83.00 μL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.03 g偶氮二异丁腈，超声混合，通氮气，密封，放入恒温水浴箱反应12 h。取出聚合物粉碎，过120目筛，甲醇索式提取6 h，恒温干燥90 min即得印迹聚合物（MIP）。

同样方法制备空白聚合物（NIP）。

2.2 静态吸附试验

称取40 mg MIP及NIP，各9份，分别加入不同浓度熊果酸甲醇溶液（浓度1～9 mmol·L-1），室温振荡平衡6 h，离心30 min，取适量上层清液，测定平衡溶液吸光度。用式（1）计算聚合物吸附量（Q），考察聚合物吸附性能。

式中：C0为初始浓度，mmol·L-1；C为吸附浓度，mmol·L-1；V为溶液的体积，mL；m为聚合物质量，mg。

2.3 吸附选择性试验

分别以熊果酸相似物白桦脂酸、羽扇豆醇为底物（结构见图1），考察熊果酸印迹聚合物吸附选择性能。以乙腈为溶剂，配制0.2 mmol·L-1白桦脂酸、羽扇豆醇溶液，测定其紫外吸光度，计算吸附前后溶液浓度及聚合物对各底物的吸附量。

图1 结构式

2.4 分子印迹固相萃取黄毛耳草中的熊果酸

2.4.1 固相萃取柱的制备

取一根商品固相萃取柱（1 mL，100 mg），倒出吸附剂，柱体及滤板用甲醇超声洗涤，称取0.10 g的熊果酸聚合物加入柱中，用20 mL甲醇充分润湿平衡。

2.4.2 黄毛耳草粗提液的制备

将黄毛耳草晾晒干燥，粉碎，称取10 g粗粉，用200 mL乙醇索氏提取2 h，过滤后浓缩至干，甲醇溶解即得。

2.4.3 黄毛耳草中熊果酸的萃取分离

将1 mL黄毛耳草提取液加入固相萃取柱中，用5 mL甲醇淋洗，5 mL甲醇-乙酸（8:2，V/V）溶液洗脱，流速为0.3 mL·min-1。流出液均干燥后用甲醇溶解，HPLC分析。分析条件：Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流速1.0 mL·min-1，检测波长210 nm，流动相为甲醇-水。

3 结果与讨论

3.1 红外光谱试验

由图2可知，红外光谱中有羟基强峰（3 528 cm-1）、羧酸羰基（1 717 cm-1）、—CH3强峰（2 956 cm-1）和—CH2峰（2 922 cm-1）；并展示出熊果酸的典型结构吸收峰，包括两个基本骨架特征，即：熊果酸A区1 441，1 367和1 363 cm-1；熊果酸B区1 304，1 272和1 252 cm-1。聚合物的红外谱图在3 000 cm-1处的烷烃峰明显减弱，在3 528 cm-1处的—OH峰明显减弱，在1 717 cm-1处的—C==O峰也明显减弱，表明熊果酸的羰基与羟基均参与了反应；从图2中还可以看出，由于形成了新的聚合物，熊果酸典型结构吸收有所减弱或合并。图3为印迹过程示意图。

图2 熊果酸（a）、熊果酸聚合物（b）红外光谱

图3 印迹过程示意图

3.2 印迹聚合物吸附等温线

如图4所示，MIP吸附曲线呈先快速增加后趋于平衡的结合特点，在测定浓度范围内，MIP对熊果酸的吸附量均远远大于NIP对熊果酸的吸附量。这表明与空白聚合物比较，所制备MIP对熊果酸具有更好的吸附性能，体现出良好的特异性吸附特点。

3.3 印迹聚合物吸附选择性

为进步一研究熊果酸分子印迹聚合物的吸附特性，使用了与熊果酸分子结构相似的羽扇豆醇、白桦脂酸作为对照品，分别测定了熊果酸印迹聚合物对二者的吸附量，由结果可看出，熊果酸印迹聚合物对熊果酸分子的吸附量远远大于对羽扇豆醇和白桦脂酸的吸附量，表现出良好的锁钥特点。同时可以看出，由于白桦脂酸与熊果酸结构更相似，其吸附量大于羽扇豆醇。用a、ε参数进一步说明结合特点，a为印迹聚合物和空白聚合物对熊果酸吸附量之比，其值越大，聚合物吸附效果越好；ε为印迹聚合物对熊果酸和对照品吸附量之比，值越大，聚合物吸附选择性越好。由结果可知，熊果酸a为2.76，表示印迹聚合物具有良好的印记效果，相对于羽扇豆醇和白桦脂酸的ε均大于2，表现出较好的选择性。

3.4 黄毛耳草中熊果酸的固相萃取试验

将所制备的熊果酸分子印迹聚合物用于黄毛耳草提取液的固相萃取。从图5色谱图可看出，黄毛耳草成分较为复杂，其中熊果酸含量较高。将1 mL黄毛耳草提取液加入印迹聚合物固相萃取柱，用甲醇进行淋洗，从淋洗液色谱图可以看出，淋洗液中基本检不出熊果酸，说明印迹聚合物已将熊果酸选择性吸附，熊果酸未进入淋洗液；淋洗完毕，用乙酸、甲醇混合溶液对印迹聚合物萃取柱进行洗脱，洗脱液中已无其他物质，只检出熊果酸。从分析结果可看出，制备的熊果酸分子印迹聚合物对熊果酸具有明显的特异性吸附，吸附性能良好，可用于固相萃取填料实现对黄毛耳草中熊果酸的分离与富集。

图4 聚合物对熊果酸吸附量

表1 聚合物对底物的选择性

图5 色谱图

4 结论

以丙烯酸为单体，在乙二醇二甲基丙烯酸酯交联作用下合成了熊果酸分子印迹聚合物，经过红外光谱分析验证了其结构，通过静态吸附试验及选择性能测试考察了聚合物对熊果酸的特异性吸附能力，结合固相萃取技术对黄毛耳草提取液进行了进一步的分离；结果表明，所制备的熊果酸分子印迹聚合物结构稳定，对熊果酸具有较强的特异性选择吸附性能，作为固相萃取吸附剂，可有效地对黄毛耳草中熊果酸进行分离与富集。基于特异性识别性强、选择性高、成本低等特点，熊果酸分子印迹聚合物与固相萃取、液相色谱等技术相结合，可广泛应用于中药材中熊果酸的提取、样品中痕量熊果酸富集与分析等领域，具有广阔的应用前景。