芦笋膳食纤维及酚类物质的抗氧化活性

尹培培，刘昌衡，赵鲁豫，刘永，张绵松，贾爱荣*

1. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省科学院生物研究所（济南 250103）；2. 菏泽巨鑫源食品有限公司（菏泽 274400）

芦笋（Asparagus officinalis L.）又名石刁柏、龙须菜，为百合科天门冬属多年生草本植物[1]，主要分为绿芦笋和白芦笋两种。芦笋含有人体不可或缺的氨基酸、矿物质、维生素等多种营养成分，还含有膳食纤维、皂角苷类及酚类等多种生物活性成分[2]，具有抗肿瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、调节免疫力、抗衰老、抗疲劳等生物学功能[3-5]，因此深受人们的喜爱。

芦笋含有丰富的膳食纤维，膳食纤维被称为继水、碳水化合物、矿物质、维生素、蛋白质、脂肪之外的“第七大营养素”，能有效减少和预防心脑血管疾病、肥胖、糖尿病、高血压、便秘等疾病的发生[6]，具有抗氧化、清除自由基和提高人体免疫力等作用[7]。随着人们饮食习惯的改变，各类“文明病”不断出现，膳食纤维的重要性逐渐被人们认识。许多研究成果已被应用到食品行业中[6]。通过酶法提取芦笋膳食纤维，可以充分利用芦笋资源，加快芦笋产业的发展。

此外，国内外研究表明，芦笋含有大量的黄酮类化合物，主要为芦丁、槲皮素、水仙苷、烟花苷等[8-9]，且芦笋中黄酮含量高于一般蔬菜[10]。植物黄酮类物质具有较强的抗氧化活性，对清除体内自由基、延缓人体衰老及各种心脑血管疾病等具有积极作用。然而，目前对两种芦笋中膳食纤维的酶法提取及可溶性膳食纤维、酚类物质的抗氧化活性的比较性研究匮乏。因此拟分别采用酶解和超声辅助的方式提取白芦笋和绿芦笋中的膳食纤维和酚类物质，并比较两种芦笋中可溶性膳食纤维和酚类物质的抗氧化活性，以期为衡量芦笋的食用和药用价值提供科学依据，为绿芦笋和白芦笋的深度开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

绿芦笋和白芦笋由菏泽巨鑫源食品有限公司提供。采集新鲜的白芦笋和绿芦笋，清水洗净基部污垢，立即放入105 ℃烘箱15 min进行灭酶，然后置于50 ℃烘箱干燥至恒质量。采用中药粉碎机将样品粉碎，保存至-20 ℃冰箱备用。

2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、6-羟基-2, 5, 7, 8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸（水溶性维生素E；Trolox）、福林酚溶液、脂肪酶等均购于美国Sigma公司；中温淀粉酶（中温LT型）、糖化酶CN4型、中性蛋白酶购自丹麦DANISCO（丹尼斯克）公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备

5804 R型台式离心机，德国艾本德；DHG-9070 A型电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；HHS 21-4-S型水浴锅，上海新苗医疗器械制造有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；NPCA-02型氮磷钙测定仪，上海洪纪仪器设备有限公司；Infinite M 200 Pro型多功能酶标仪，瑞士TECAN；KQ-400 KDE型超声波提取仪，江苏昆山超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芦笋中可溶性膳食纤维及不可溶性膳食纤维的提取

称取绿芦笋和白芦笋粉末各80 g于锥形瓶中，分别加入2 400 mL蒸馏水和25 g脂肪酶，在pH为9.0，40℃条件下作用2 h除脂肪并灭酶；将两种样品于100 ℃糊化15 min，在pH为6.0，70 ℃条件下，加600 mL α-淀粉酶（中温LT型）反应1 h除淀粉并灭酶；继续加入48 mL糖化酶，在pH为4.75，60 ℃条件下作用2 h，灭酶；最后加入48 mL中性蛋白酶，在pH为6.99，50℃条件下作用1 h。

将上述样品于8 000 r/min离心15 min，上清液加入4倍体积无水乙醇沉淀，静置过夜，离心，将沉淀烘干即得可溶性膳食纤维，分别为白芦笋可溶性膳食纤维（W-SDF）和绿芦笋可溶性膳食纤维（G-SDF）；沉淀用蒸馏水清洗3遍后，于50 ℃烘干即得不可溶性膳食纤维，分别为白芦笋不可溶性膳食纤维（W-IDF）和绿芦笋不可溶性膳食纤维（G-IDF）。

1.2.2 芦笋膳食纤维的基本理化指标测定

淀粉含量测定，GB 5009.9—2008食品中淀粉的测定；脂肪含量测定，GB 5009.6—2016索氏提取法；蛋白含量测定，GB 5009.6—2016凯氏定氮法；灰分含量测定，GB 5009.6—2016高温灼烧法。

1.2.3 芦笋酚类物质的提取

准确称取每份为1.000 g的芦笋样品，各3份，置于50 mL离心管中，分别加入10 mL体积分数为80%的乙醇水溶液，摇匀，置于超声波提取仪中超声提取30 min，冷却至室温，过滤；残渣重复以上步骤提取两次，合并三次滤液即得。此溶液用于测定两种芦笋中酚类物质含量及其抗氧化活性，分别为白芦笋总酚（W-TF）和绿芦笋总酚（G-TF）。

1.2.4 总酚含量的测定

将40 μL福林酚溶液加到96孔板中，再加入20 μL样品、空白及标准品溶液，混合均匀；室温孵育5 min，加入140 μL的Na2CO3溶液，混合均匀；置于40 ℃烘箱中避光孵育30 min后，于765 nm波长下检测，每个样品设置三次重复。以没食子酸浓度为横坐标（x），吸光度（OD）为纵坐标（y），建立标准曲线。根据标准曲线计算被测样品溶液中没食子酸浓度当量，总酚含量以没食子酸当量（Gallic acid equivalent，GAE）表示，结果表达为mg GAE/g干质量。

1.2.5 总黄酮含量测定

将120 μL样品、空白及标准品溶液加到96孔板中，加入8 μL亚硝酸钠溶液，混合均匀，室温孵育6 min，加入8 μL的AlCl3溶液，混合均匀，室温孵育5 min，最后加入100 μL的NaOH溶液混匀，室温避光孵育30 min，用酶标仪于410 nm波长下检测，每个样品重复三次。以芦丁浓度为横坐标（x），吸光度（OD）为纵坐标（y），建立标准曲线。根据标准曲线计算被测样品溶液中芦丁浓度当量，总黄酮含量用芦丁当量（Rutin equivalent，RE）表示，表达为mg RE/g干质量。

1.2.6 芦笋中可溶性膳食纤维及酚类物质抗氧化能力测定

1.2.6.1 DPPH抗氧化能力

将10 μL的Trolox、样品及空白溶液加到96孔板中，加入40 μL新鲜配制的DPPH甲醇溶液，混合均匀后加入190 μL的甲醇溶液，以200 r/min振摇1 min；室温避光孵育30 min。用酶标仪于517 nm波长下检测，每个样品重复三次。自由基清除活性RSA=（AO-AS）/AO×100%，AS为样品溶液吸光度，AO为空白溶液吸光度。根据标准曲线计算DPPH自由基清除能力。结果表示为Trolox当量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干质量。

1.2.6.2 ABST抗氧化能力

将5 μL的Trolox、样品及空白溶液加到96孔板中，再加入200 μL新鲜配制的ABTS+·工作液，室温避光孵育5 min。用酶标仪于734 nm波长下检测，每个样品重复三次。自由基清除活性RSA=（AO-AS）/AO×100%，AS为样品溶液吸光度，AO为空白溶液吸光度。根据标准曲线计算ABTS自由基清除能力。结果表示为Trolox当量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干质量。

1.2.6.3 还原力

准确量取0.4 mL待测样品溶液或空白溶液，再加入1 mL磷酸缓冲液及1 mL铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）溶液，混合均匀，于50 ℃水浴孵育20 min；再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，室温孵育10 min。取1 mL上述溶液，加入1 mL蒸馏水和0.2 mL 0.1 g/100 mL氯化铁溶液，均匀混合，用分光光度计于700 nm处测定吸光度。溶液的吸光度越高，还原力越强，反之越弱。结果表示为Trolox当量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干质量。

1.2.7 统计学分析

结果表达为平均值±标准偏差（SD），试验至少重复3次。数据的显著性差异（t检验：等方差双尾检验）采用Microsoft Excel数据分析软件（Microsoft Office Excel 2016，Microsoft Corp. Redmond，WA，USA）。p＜0.05差异显著，p＜0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 芦笋中可溶性膳食纤维及不可溶性膳食纤维含量

膳食纤维作为一种功能性食品配料具有多种生物功效，其制备和生物活性研究已成为现阶段的研究热点[11]。膳食纤维常用的提取方法有酶法、酶-化学法、酸碱法、微生物发酵法以及物理法等[12-13]。酶法提取条件温和，安全无毒，节约能耗，操作方便，利于工业化生产，且对环境污染少。因此研究采用酶法制备芦笋中的可溶性膳食纤维及不溶性膳食纤维。由图1可知，白芦笋和绿芦笋中都含有丰富的可溶性和不可溶性膳食纤维，且两种芦笋中可溶性膳食纤维的含量均显著高于其自身的不可溶性膳食纤维的含量；绿芦笋中两种膳食纤维的含量均分别高于白芦笋中两种膳食纤维的含量，其含量从高到低依次为：G-SDF＞W-SDF＞G-IDF＞W-SDF。研究采用的白芦笋和绿芦笋为同一品种，其唯一区别在于绿芦笋经过正常光合作用呈现出绿色，而白芦笋在整个生长周期里全部在地底下，避光生长，口感细腻。因此推测，光照有利于芦笋中两种膳食纤维的合成。

2.2 绿芦笋及其膳食纤维的理化指标

表1为绿芦笋及其两种膳食纤维的理化指标值。从表1中可知，芦笋样品中蛋白质、淀粉、脂肪及灰分的总量占芦笋干质量的39.632%，而不可溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维中蛋白质、淀粉、脂肪及灰分的总量分别占其干质量的10.478%和21.6%，这说明通过酶法提取的两种芦笋膳食纤维纯度较高，可作为高纯度膳食纤维用于食品添加剂等方面。

图1 白芦笋和绿芦笋不溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维提取率

表1 绿芦笋及其两种膳食纤维的理化指标

2.3 芦笋中总酚和总黄酮的含量

2.3.1 没食子酸和芦丁标准曲线

为了准确测定芦笋中总酚和总黄酮的含量，分别建立没食子酸和芦丁标准曲线，结果如图2所示。图2（A）为测定总酚所用的没食子酸标准曲线，其线性回归方程为：y=0.005 4x+0.085 8，R2=0.996 6，表明没食子酸质量浓度在0～400 μg/mL范围内线性关系良好；图2（B）为测定总黄酮所用的芦丁标准曲线，其线性回归方程为：y=0.003 7x+0.048 8，R2=0.999 4，表明芦丁质量浓度在0～100 μg/mL范围内线性关系良好。

图2 测定总酚和总黄酮所建立的没食子酸和芦丁的标准曲线

2.3.2 芦笋中总酚及总黄酮含量

图3为白芦笋和绿芦笋中总酚和总黄酮的含量。由图3可知，绿芦笋总酚和总黄酮的含量均显著高于白芦笋，白芦笋中总酚和总黄酮的含量分别为2.89±0.16 mg GA/g和10.45±0.43 mg RE/g，绿芦笋中总酚和总黄酮的含量分别为6.76±0.43 mg GA/g和23.12±0.50 mg RE/g。在自然界中，黄酮类化合物是大多数植物体自身存在的一类最主要的抗紫外的化合物，它能够有效吸收紫外线，使植物体器官组织，尤其是光合作用组织免受或少受辐射损害[14]。因此推测光照有利于芦笋中黄酮类化合物的合成，从而导致绿芦笋中总酚及总黄酮含量均高于白芦笋。

2.4 芦笋可溶性膳食纤维及酚类物质的抗氧化活性

2.4.1 Trolox标准曲线

植物中存在的酚类物质，如黄酮、酚酸及单宁等，是其发挥抗氧化活性的主要因素[15]。研究表明，不同抗氧化剂存在不同的抗氧化机制，因此单一的抗氧化方法很难全面反映包含多种化合物的植物提取物的抗氧化能力[16-17]。为了准确测定各样品的抗氧化活性，采用了DPPH及 ABTS自由基清除能力和还原力测定三种试验方法。DPPH、ABTS自由基清除能力和还原力的Trolox标准曲线分别如图（图4）所示：y=0.190 6x+1.410 3，R2=0.994 6；y=0.220 2x+2.747 1，R2=0.994 6；y=0.002 1x+0.055 2，R2=0.998 9，且Trolox质量浓度在0～400 μg/mL范围内线性关系良好。

图3 白芦笋和绿芦笋总酚和总黄酮含量

图4 DPPH、ABTS自由基清除能力和还原力的Trolox标准曲线

2.4.2 芦笋可溶性膳食纤维及酚类物质抗氧化活性

2.4.2.1 DPPH自由基清除活性

四种样品的DPPH自由基清除能力如图5所示。自由基的清除能力变化越快，表示物质的氢原子供给能力越强[18]。结果显示，绿芦笋中可溶性膳食纤维和酚类物质的DPPH自由基清除能力分别显著高于白芦笋；白（绿）芦笋酚类物质的DPPH自由基清除能力显著比可溶性膳食纤维强；白芦笋中可溶性膳食纤维 DPPH自由基清除能力最弱，基本为零，而绿芦笋酚类物质的抗氧化能力最强，白芦笋酚类物质与绿芦笋可溶性膳食纤维的DPPH自由基清除能力没有显著性差异。

2.4.2.2 ABTS自由基清除活性

图6为四种样品的ABTS自由基清除能力。四种样品的ABTS抗氧化能力显著不同，且绿芦笋的ABTS自由基清除能力显著高于白芦笋，酚类物质的抗氧化活性高于可溶性膳食纤维，即W-SDF＜W-TF＜G-SDF＜G-TF。

2.4.2.3 还原力

四种样品的还原能力如图7所示，其还原力与ABTS自由基清除能力趋势基本一致，且绿芦笋的抗氧化活性高于白芦笋，酚类物质的抗氧化活性高于可溶性膳食纤维，即W-SDF＜W-TF＜G-SDF＜G-TF。

通过比较两种芦笋中可溶性膳食纤维、总酚、总黄酮的含量及三种抗氧化能力发现，样品的抗氧化活性与其活性物质的含量趋势相同。初步推测，芦笋中酚类物质是其抗氧化活性的主要贡献者，且芦笋抗氧化能力的强弱与其总酚和可溶性膳食纤维的含量有关，总酚和可溶性膳食纤维的含量越高，其抗氧化能力越强；光照有利于植物抗氧化物质的合成。

图6 白芦笋和绿芦笋的可溶性膳食纤维及其酚类物质的ABTS自由基清除活性

图7 白芦笋和绿芦笋的可溶性膳食纤维及其酚类物质的还原力

3 结论

分别采用酶法和超声波辅助提取两种芦笋中的膳食纤维和酚类物质。结果显示：绿芦笋中可溶性膳食纤维、不可溶性膳食纤维、总酚和总黄酮的含量均分别显著高于白芦笋中的含量。经过酶法提取后，芦笋的可溶性和不可溶性膳食纤维的纯度高，有利于作为一种高纯度的膳食纤维添加剂。抗氧化能力结果显示：绿芦笋的可溶性膳食纤维和酚类物质的抗氧化活性均显著高于白芦笋，且芦笋酚类物质是其抗氧化活性的主要贡献者。综上所述，芦笋，尤其是绿芦笋，具有较强的抗氧化活性，并且是一种优质的膳食纤维的来源，这为芦笋的进一步开发利用提供科学依据。