染色体拷贝数变异国家参考品的制备及标定

贾峥 张文新 李丽莉 孙楠 曲守方 黄杰

拷贝数变异（copy number variations，CNVs）指在人类基因组中广泛存在的，从1 000 bp到数百万bp范围的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异，主要表现为染色体亚显微水平的缺失和重复，是由基因组发生重排而导致的[1]，常导致人类复杂性疾病如肿瘤[2]、自闭症[3]、精神分裂症[4]、先天畸形[5]、发育迟缓和智力低下[6-8]。

随着分子生物技术的发展，染色体拷贝数变异检测的方法也由传统的核型分析[9]，发展到荧光原位杂交技术法（fluorescence in situ hybridization，FISH）[10]、荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）和多重链接探针法（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）[11-12]、染色体微阵列分析（chromosomal microarray，CMA）[13-16]和高通量测序技术（Next generation sequencing technology，NGS）[17]等。然而目前在染色体拷贝数变异检测中，国内外都缺乏统一认可的国家参考品。本实验室计划研制一套能够进行染色体拷贝数变异检测性能评估的国家参考品，为相关试剂盒的注册检定及临床检验室间质评提供优质可靠的国家参考品。

1 材料与方法

1.1 研究对象

招募自愿参与项目的临床样品捐献者。部分微缺失微重复样本是通过EB病毒转染永生化获得的外周血B淋巴细胞系样本。本研究共收集到3份正常人样本，24份染色体非整倍体异常样本，11份微缺失微重复样本。

1.2 主要试剂

康宁公司的DNA提取试剂盒AxyPrep Mag Tissue-Blood genomic DNA（gDNA）Kit（磁珠法）；染色体拷贝数变异检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法），批号：28180101Y，深圳华大智造科技有限公司（以下简称为A公司）提供；染色体拷贝数变异检测试剂盒（可逆末端终止测序法），批号：GM016-P320180102，杭州杰毅麦特医疗器械有限公司（以下简称为B公司）提供；染色体拷贝数变异检测试剂盒，（可逆末端终止测序法），批号：R2000180301，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司（以下简称为C公司）提供；13/16/18/21/22/X/Y染色体非整倍体检测试剂盒（微阵列芯片法），批号：201703，广州市达瑞生物技术股份有限公司（以下简称为D公司）提供。

1.3 主要仪器

BGISEQ-500基因测序仪，A公司提供；Next-Seq CN500基因测序仪，B公司和C公司提供；GCS 3000Dx v.2微阵列基因芯片分析系统，D公司提供。

1.4 方法

1.4.1 国家参考品的制备

按照DNA提取试剂盒说明书进行38份样本基因组DNA的提取，选取5例微重复微缺失DNA与正常人的基因组DNA量进行3∶7比例混合得到5例30%微缺失微重复嵌合样本，即最终得到43份样本。将提取的基因组DNA，在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA样本的完整性。使用NanoDrop对得到的基因组DNA测定OD260/OD280和OD260/OD230值来检测DNA样本的纯度，并使用琼脂糖凝胶电泳方法对基因组DNA的完整性进行检测。最后使用Qubit Fluorometer3.0对基因组DNA进一步准确定量，然后将DNA样本稀释到15（±1）ng/μL。采用NGS对每个DNA样本进行实验验证，将验证合格的DNA样本进行分装，并贴上标签。

1.4.2 国家参考品的性能验证

分别使用4家协作标定单位生产的染色体拷贝数检测试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作，评价国家参考品的性能。

1.4.3 国家参考品的稳定性和均匀性验证

DNA样本常规均在-20℃以下保存，且运输过程中均使用干冰或冰袋保存。为了验证国家参考品的稳定性，随机选两套国家参考品，其中一套国家参考品放置于37℃条件下4周；另一套国家参考品放置于37℃条件下4周，期间拿出反复冻融3次（每隔4天一次）。采用A公司的染色体拷贝数变异检测试剂盒对这两套国家参考品进行检测，用来评价国家参考品的稳定性，同时随机取三套国家参考品，进行均匀性验证。

2 结果

2.1 国家参考品的制备及验证

在分子生物学实验中基因组DNA的提取是进一步研究基因组结构、功能和指纹遗传标记等的第一步，提取的DNA的完整性和纯度是后续诸多复杂高级实验分析成败的关键。对于43份样本提取的基因组DNA进行电泳，电泳图谱结果显示DNA条带完整和锐利，没有拖带或弥散带，符合实验室对基因组DNA完整性的要求，见图1。采用紫外分光光度检测，提取的DNA样品的OD260/OD280值基本在1.8～2.15之间，表明DNA的纯度较高。经高通量测序方法对每个样本进行拷贝变异的检测，样本的DNA检测结果均与原始样本的信息一致，最后按照17 μL体积进行分装。

图1 43份样本提取的DNA质量验证Figure1 The quality of extracted genomic DNA from 43 samples

2.2 国家参考品的性能验证

实验室邀请4家协作标定单位，选择了高通量测序法和基因芯片法对国家参考品进行性能验证。四家单位验证结果见表1，其中A单位和B单位对国家参考品43份样本的检测结果均与参考品标示的结果一致；C单位除了检测出参考品标示的结果外，还有9份样本多检出其他的拷贝数变异，包含了7份样本多检出1个小于1M的重复片段，1份样本多检出1个小于1M的缺失片段，另有1份样本检测出1个21.6M的缺失片段；D单位对国家参考品中40号样本未检测到1p36嵌合型微缺失，其他42份样本均检测出参考品标示的结果，另外还有4份样本多检出其他的拷贝数变异，包括1份样本较其他三家单位多检出一个3.7 M的片段重复以及其他3份样本分别多检测出11.3 M，12.7 M，29.8 M的缺失片段。

为了评价试剂盒的嵌合体样本检测能力，设置了微缺失微重复嵌合体（约30%嵌合比例）样本。3家单位的基于高通量测序方法的试剂盒，对5份样本均能正确检出；而40号样本存在着两种嵌合体（约30%嵌合比例），基于基因芯片法的试剂盒存在着漏检现象。四家单位对Wolf-Hirschhorn综合征30%嵌合的检测结果如图2所示，4家协作单位均对该综合征检出。

2.3 国家参考品的稳定性和均匀性验证

标准物质的均匀性和稳定性亦是重要的条件。均匀性可保证一批原料所制备的标准物质均匀一致，稳定性可使一批标准物质长期分发使用，以保持特性值的连续性。实验室通过对两种不同的处理方法：37℃放置4周，期间反复冻融（称为条件1）；或者37℃放置4周（称为条件2）后由A公司使用高通量测序方法进行国家参考品稳定性和均匀性验证，结果如表2所示。

通过对这两套国家参考品的稳定性进行检测，结果均与国家参考品标示的结果一致，表明国家参考品稳定性满足要求。同时使用一家协作标定单位的染色体拷贝数变异检测试剂盒，检测不同的3套国家参考品，作为参考品均匀性的验证，结果表明该3套国家参考品的结果均与国家参考品标示的结果一致，表明均匀性也满足要求。

3 讨论

大量研究表明，基因组变异是人类进化、疾病产生和发展的重要因素之一，其中拷贝数变异作为人类基因组中重要的结构性变异，在病理和生理中扮演着重要的角色。近年来，随着基因组测序技术的迅猛发展，拷贝数变异的检测精度已达到50 bp[18]。其中特征性的CNVs可以作为染色体病的诊断指标，而准确的检测则是发现和揭示这些CNVs的前提。根据特征性的CNVs，可对相应的疾病进行准确诊断并提出相对应的最有效的解决方法。目前我国还没有拷贝数变异的国家参考品，而市场上存在高通量测序方法、微阵列比较基因组杂交芯片法（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）及微阵列单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技术等多个不同原理的检测平台。所以为了更好的评价不同公司以及不同使用平台的体外诊断试剂盒的生产质量和工艺优化水准，建立标准化的统一的国家参考品是非常必要的。

表1 4家协作标定单位验证结果Table1 Verification results of references by detection kits from four manufacturers

续表1

图2 4家协作标定单位对Wolf-Hirschhorn综合征30%嵌合样本的检测结果Figure2 Verification results of 30%Wolf-Hirschhorn syndrome by detection kits from four manufacturers

表2 不同处理条件对参考品稳定性的影响Table2 Stability of references treated under various conditions

该国家参考品中除了1号和19号染色体属非整倍体外，其他染色体的非整倍体均已包含，同时增加了临床上相对常见或发病率较高的综合征样本，更能有效的评价试剂盒的临床意义。根据生物制品国家标准物质制备和标定规程，用于制备标准物质的原材料应有足够的稳定性和高度的特异性，并有应有足够的数量[31]。因此，本研究所制备的参考品选用了流产组织样本及细胞系能确保基因型背景明确、原料来源稳定，且满足标准物质制备的量要求及换批时一致性的样品。

在4家公司对参考品进行标定的结果中，除了一家协作标定单位在使用含有单核苷酸多态（SNP）探针的微阵列芯片法进行验证时，结果中有一例嵌合体参考品并未正确检出外，其他3家单位对国家参考品所有的标示结果均有正确检出。究其原因，可能是由于SNP探针的基因芯片法检测拷贝数的原理需要通过SNP位点信息来区分等位基因，对于真实临床样本的嵌合来说（包括父源和母源染色体），30%嵌合比例的样本可以用该芯片法进行准确判读。而国家参考品的嵌合参考品是由拷贝数正常和异常样本按照一定的比例配制而成的模拟样本，这种人工配制的嵌合型参考品会对SNP探针的微阵列芯片法的检测质控和结果均有一定程度的干扰，从而影响了对微缺失微重复综合征（30%嵌合体）检测限样本的检测准确性。

从分析结果来看，该参考品具有较好的稳定性和均匀性，可满足运输稳定性的要求。该参考品需在低温冷冻条件下进行长期保存，根据国际惯例，目前人类基因检测相关试剂评价国家参考物质不设“有效期”，由我院对标准物质进行定期监测。

综上所述，本实验室制备了染色体拷贝数变异检测国家参考品，该参考品可满足染色体DNA拷贝数变异的检测要求，经多家实验室进行验证，可用于国内大多数试剂盒的性能评价及临床实验室质量评价。