GaAlAs激光对牙髓中Shh蛋白表达的影响

吕学超

哈尔滨医科大学附属口腔医院儿童口腔科，黑龙江哈尔滨 150001

当牙髓牙本质复合体受到损伤时，原发性牙本质连同下层牙髓组织表现出退行性病变。随着新分化的成牙本质细胞样细胞取代坏死牙本质细胞有助于产生新的矿化组织。在此过程中牙髓干细胞发挥了作用，然而其分子机制尚不明确。镓铝砷（GaAlAs）半导体激光可以用来加速牙髓牙本质复合体的矿化。有报道在直接盖髓术中应用GaAlAs半导体激光辅助治疗暴露牙髓组织比常规直接盖髓成功率高[1]。

Shh蛋白最早在果蝇中发现，这类分泌性蛋白，能够自身发生水解，研究发现，Shh通路在许多哺乳动物胚胎发育中起着关键作用，在干细胞增殖分化、肿瘤发生、神经干产生、牙胚发育和骨骼生长发育等许多生物学行为中起着调节作用[2]。Shh基因仅有1种类型,哺乳动物包括3种同源的类别:分别是Shh、Dhh、Ihh。这3种基因序列体现出高度同源的特征，Dhh能够参与生殖细胞的产生及发育；Ihh对软骨发育有影响作用；而在Hedgehog家族中表达最多的为Shh，发挥主要的信号传导功能[3]。研究发现，Shh能够参与细胞在肢体、神经管及体节中的分化建立，对神经管D-V的发育模式、胚胎早期的不对称发育模式、肢体A-P的发育模式以及体节形成模式均发挥调节作用，还可参与形成某些器官组织的形态构成，如脑、肺脏、眼、脊索、牙齿、毛发及四肢等，还与肿瘤的产生密切相关。通过Shh基因敲除动物的脑、肢体、颅面部及脊索的畸形现象十分突出。因为果蝇中的Hedgehog仅一种，研究具有便利性,因此常把果蝇作为研究对象。虽然说脊椎动物中的形式更多，但研究已证实果蝇的Hedgehog信通路能够保留在脊椎动物体内，因此提示其功能具有某些相似之处[4]。

Shh途径包括 Shh、CI/GLI二聚体、SMO。Shh作为一种激活剂，可以与特定的细胞表面受体SMO和修补后的跨膜蛋白连接，起到信号转导作用。SMO是Shh通路的关键激活剂，可以与Shh连接产生复合物[5]。一般来说，Patched抑制SMO的活性。当 Shh与Patched结合时，Patched失去了对SMO的抑制作用。同时，Patched激活转录因子Ci/Gli二聚体的活性，将激活的Ci/Gli二聚体转移到细胞核，调节下游基因的表达，激活Shh信号通路。其中Shh信号通路调控的下游基因可能包括:Ptc、WNT、BMP2、Msx 等[6]。该实验（2017年2月—2018年2月）旨在评估GaAlAs激光对牙髓中Shh蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 标本制备及分组

采用因牙周病拔除的健康第一磨牙（口腔门诊获得）用脉冲810 nm的GaAlAs半导体激光对近中面进行照射180 s，输出功率为1.5 W。在激光照射期间，激光纤维的尖端保持接触牙面，非照射牙齿作为对照组，分别在照射后的3、7和11 d进行免疫组织化学染色。

1.2 实验步骤

1.2.1 标本的固定和包埋①将准备完毕标本装入脱水试剂盒并放入冲水池子4 h。②将标本由按说明书梯度脱水。③二甲苯透明:从100%乙醇溶液中取出样品，干燥，然后放入二甲苯溶液I中。用二甲苯代替无水乙醇约50 min。样品在二甲苯中放置约2 h。④标本的浸蜡:将已完成的实验样品分别放入石蜡中浸润各两个钟头。⑤包埋:将已经溶解的石蜡倒入包埋器中，并将浸好的组织块切面朝下包埋。

1.2.2 切片 用切片机连续切片石蜡牙。获得厚度为5 μm的切片并固定在显微镜的载玻片上。

1.2.3 标本的嗜伊红苏木素(hematoxylineosinstainHE)染色 每个标本的一个载玻片均用苏木精-伊红染色，经过综合性组织学分析评定整个冠髓和根髓情况。

1.2.4 免疫组织化学染色 采用SABC法SHH蛋白免疫组化试剂盒作为武汉博斯特公司的产品。PBS作为空白对照而不是第一个抗体。主要步骤为：常规脱蜡和水合；用3%过氧化氢去除内源过氧化物酶；阻断正常血清；过夜用1抗体在4℃；加入生物素化2H，ABC复合体2 h，DAB染色；苏木精再染色，透明性和密封性。

1.3 图像分析和统计分析

采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统。利用图像分析软件，从实验组每个阳性染色部位随机选取9个视场，测定其平均光密度（IOD）。测量并计算了对照组相应部位9个视场的平均光密度（IOD）。分别对各组光密度值进行t检验。

2 结果

光密度值结果见表1，免疫组织化学染色结果见图1~4。

表1 牙髓Shh蛋白光密度值的统计结果（±s）

表1 牙髓Shh蛋白光密度值的统计结果（±s）

注：各组之间均差异有统计学意义（P＜0.05）。

指标 3 d 3 d 11 d Shh 121.611±8.232 1 121.998±6.512 3 623.545±1.321

图1 HSP70在对照组中表达。（×200）

图2 Shh在照射3 d年轻恒牙牙髓中表达。（×200）

图3 Shh在照射7 d年轻恒牙牙髓中表达。（×200）

图4 Shh在照射11 d年轻恒牙牙髓中表达。（×200）

3 讨论

GaAlAs半导体激光是一种非磨料激光器。它可以用来加速牙本质/牙髓复合体的矿化。GaAlAs半导体激光辅助治疗因龋暴露的牙髓组织报告显示明显比常规直接盖髓术成功率高，表明GaAlAs激光作用源于它的去污和止血能力[7]。

Shh能够参与细胞在肢体、神经管及体节中的分化建立，对神经管D-V的发育模式、胚胎早期的不对称发育模式、肢体A-P的发育模式以及体节形成模式均发挥调节作用，还可参与形成某些器官组织的形态构成，如脑、肺脏、眼、脊索、牙齿、毛发及四肢等，还与肿瘤的产生密切相关。通过Shh基因敲除动物的脑、肢体、颅面部及脊索的畸形现象十分突出[8]。Shh蛋白是Shh家族的重要成员之一。分子量为70 kd。它在牙髓细胞的耐热性、分子保护和信号转导中起着重要作用。结果表明，在一定程度的预热刺激下，SHH-hsp70的表达增加，可以恢复牙髓细胞间的通讯，增强碱性磷酸酶的活性。这些反应表明SHH是一种细胞。保护因素起着重要作用[9]。

在该研究中，采用了Shh作为成牙本质样细胞的标记物，因为有报道它能直接反应这些细胞在受到如备洞等治疗后的变化[10]，在激光照射后第3天，少量新生修复牙本质样矿化组织出现，观察到存在Shh阳性的成牙本质细胞样细胞。在第7天，出现了大量的HSP70阳性的成牙本质细胞样细胞，修复性牙本质样牙本质层变厚，7 d 达到高峰（1 121.998±6.512 3）。 在第11天时，一些细胞内含物表达Shh，而另一些则没有，修复性牙本质样牙本质层的厚度并没有明显的变化，11 d 逐渐消退（623.545±1.321）。

在牙体治疗中，抛开适应症的选择、牙髓的状态等原因直接盖髓术的失败率仍然往往非常的高，应用GaAlAs半导体激光辅助治疗牙体组织疾病不失为一种理想的治疗方法。