超声提取/气相色谱法检测食用槟榔中的甜蜜素

肖晓义，夏延斌，袁 河，赵志友

（1.湖南省槟榔加工与食用安全工程技术研究中心，湖南宾之郎食品科技有限公司，湖南湘潭 411201；2.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128）

槟榔含有多种人体所需的营养物质和微量元素，如脂肪、槟榔油、生物碱等成分[1]，其性味苦、辛、温，具有杀虫、消积等功能[2]，可药用也可食用。在我国，槟榔拥有巨大的市场，仅湖南地区产值就已达到40亿～50亿元[3]。消费者对槟榔的口感、口味有一定要求，甜度是影响槟榔口感的重要指标之一。甜蜜素（C6H11NH2）化学名称为环己基氨基磺酸钠，是一种人工合成的非营养型低热能甜味剂，其甜度为蔗糖的30～50倍，且价格低廉、后苦味小，因此被广泛用于食品加工、农业等领域[4-6]。但有研究表明甜蜜素不被人体吸收而且会加重人体肝脏负担，对肾脏有毒副作用，并具有潜在致癌性[7-9]，因此在实际过程中要严格把控甜蜜素的添加量。国家制定相关的甜蜜素检测标准（GB/T 5009.97—2003），该标准中甜蜜素的检测方法包含填充柱气相色谱法、比色法、薄层层析法[8-10]。气相色谱法测定甜蜜素时通常以环己醇亚硝酸脂作为定量依据[11-12]，但甜蜜素和亚硝酸钠在硫酸存在时会生成环己醇，环己醇可与亚硝酸钠发生酯化反应生成环己醇亚硝酸酯，此反应为可逆反应，环己醇不能完全转换为环己醇亚硝酸酯，而2种产物之间的峰面积之和一定，因此可以通过2种产物的峰面积之和进行定量分析[13-14]。

通过峰面积加和的定量方法并结合超声提取，建立了从槟榔中检测甜蜜素的方法，并通过正交试验筛选出最佳提取工艺，该方法准确度高，精密度、分离度良好，可以满足槟榔中的甜蜜素检测。

1 材料与设备

1.1 材料

市售食用槟榔。

1.2 试剂

甜蜜素（标准品纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司提供；正己烷、氯化钠、亚硝酸钠溶液、硫酸溶液。以上试剂均为分析纯。

1.3 仪器

Agilent GC7890B型气相色谱，配FID检测器，美国安捷伦公司产品；SHZ-82型恒温水浴振荡器，常州市中贝仪器有限公司产品；AR224CN型分析天平，奥豪斯仪器有限公司产品；ZWSH-250型超纯水机，湖南中沃水务环保科技有限公司产品；KQ-700E型超声波清洗机，昆山美美超声仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：HP-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；进样口：加热器温度220℃，进样量1 μL，分流比5∶1；载气N2，流量40 mL/min；柱箱温度：恒温70℃；FID检测器：温度250℃，氢气流量47 mL/min，空气流量400 mL/min，氮气流量30 mL/min。

2.2 样品前处理

选取5颗大小、形状、纹路近似的槟榔，切碎混匀，取2～3 g样品置于50 mL锥形瓶中，以超纯水为提取溶剂，采用超声的方法提取槟榔中甜蜜素，样品经超声提取后冷却至室温，取1 mL提取液置于100 mL具塞比色管中，依次加入15 mL超纯水、5 mL 50 g/L亚硝酸钠溶液和100 g/L硫酸溶液，冰浴，以转速80 r/min振摇30 min后，加入5 g氯化钠，10 mL正己烷，振摇100次，静置分层，取上层正己烷适量注入气相色谱仪中进行测定，每个样品平行3份。

2.3 单因素及正交试验

称取槟榔碎块9份，每份2.0 g，采用L9（34）正交试验表进行试验设计，结合单因素试验结果，以甜蜜素提取率为指标，考查料液比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）3个因素对甜蜜素提取率的影响。

正交提取试验因素与水平设计见表1。

3 结果与分析

3.1 单因素考查

表1 正交提取试验因素与水平设计

3.1.1 超声时间对甜蜜素提取率的影响

超声时间对甜蜜素提取率的影响见图1。

图1 超声时间对甜蜜素提取率的影响

由图1可知，随着超声时间的延长，甜蜜素提取率逐渐升高，但在60 min后甜蜜素提取率随着超声时间的延长而降低，这可能是因为超声波作用时间过长破坏了甜蜜素分子结构所致。因此选取超声时间45，60，75 min 3个水平进行正交试验。

3.1.2 提取温度对甜蜜素提取率的影响

提取温度对甜蜜素提取率的影响见图2。

图2 提取温度对甜蜜素提取率的影响

由图2可知，提取温度低于70℃时，提取温度越高，甜蜜素提取率越高。提取温度高于70℃后，甜蜜素提取率下降。造成这种现象的原因可能是在低温时，随着温度的升高，分子运动加快，使得甜蜜素从槟榔中充分释放；当温度高于70℃后，超声波与高温的协同作用使得甜蜜素分子破坏降解，导致提取所得甜蜜素含量降低。因此选取提取温度50，60，70℃3个水平进行正交试验。

3.1.3 料液比对甜蜜素提取率的影响

料液比对甜蜜素提取率的影响见图3。

由图3可知，对比料液比1∶5与1∶10，前者的甜蜜素提取率远低于后者，料液比在1∶10后，甜蜜素提取率几乎没有变化。可以判断料液比1∶10可溶解槟榔中大部分甜蜜素，所以继续增大料液比对甜蜜素含量几乎没有变化。因此，综合考虑选用料液比1∶10，1∶15，1∶20 3个水平进行正交试验。

图3 料液比对甜蜜素提取率的影响

3.2 正交试验

正交试验结果如下，结果表明，影响甜蜜素提取的主次因素为A＞B＞C，即料液比＞提取温度＞超声时间。其中，料液比与提取温度达到显著水平，其最佳提取工艺为A2B2C2，即料液比1∶15，提取温度60℃，超声时间60 min。

正交提取试验结果与直观分析见表2。

表2 正交提取试验结果与直观分析

3.3 方法学考查

3.3.1 标准曲线的绘制及检出限的测定

精确称取20.0 mg甜蜜素标准品置于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，配制成质量浓度为2 mg/mL的标准品储备液；将储备液以正己烷稀释成质量浓度为0.2，0.5，1.0，1.4，1.6，1.8 mg/mL的标准使用液，将甜蜜素标准使用液注入气相色谱仪，测定其峰面积，以标准使用液质量浓度X（mg/mL）为横坐标、相应峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。

甜蜜素标准曲线见图4。

由图4可知，在0.2～1.8 mg/mL线性范围内良好，回归方程为Y=116.967 2X-2.811 2，R2=0.999 1。对质量浓度为0.5 mg/mL的甜蜜素标准溶液上机分析5次，根据其3倍噪声值（S/N=3） 计算出检测限为13.99 μg/mL。

图4 甜蜜素标准曲线

3.3.2 准确度与精密度

经检测，正己烷空白溶剂中未检出甜蜜素，向正己烷空白溶剂中分别加入质量浓度0.5，1.0，1.5 mg/mL的甜蜜素标准溶液，充分混合均匀。通过测定正己烷空白溶剂加标后的甜蜜素质量浓度，计算实际样品的回收率。

甜蜜素加标回收率的测定见表3。

表3 甜蜜素加标回收率的测定

由表3可知，该方法对甜蜜素的加标回收率为98.0%～100.6%。

连续采用该方法对同一个样品测定6次，测量其平均值、标准偏差和相对标准偏差。

精密度结果的测定见表4。

表4 精密度结果的测定

由表4可知，相对标准偏差值均小于5%，能满足分析化学的要求。

3.4 样品检测

试验在湘潭市随机购买的5种不同品牌样品按照2.2所述处理后，以提取温度60℃，超声时间60 min，料液比1∶15进行提取，经气相色谱仪分析。

槟榔甜蜜素含量抽样检测结果见表5。

表5 槟榔甜蜜素含量抽样检测结果

以上5种品牌槟榔中的甜蜜素检出量分别为7.89，7.79，7.62，6.42，7.81 g/kg，没有超过国家标准中8 g/kg 的使用量[15]。

4 结论

采用超声提取/气相色谱法测定槟榔中甜蜜素的含量，利用单因素试验和正交试验确定了最佳提取工艺为提取温度60℃，超声时间30 min，料液比1∶15（mg∶mL）。同时，使用HP-5毛细管柱管对样品中的甜蜜素进行了分离，用组校准的方法对样品进行了定量分析。测定槟榔中甜蜜素的方法，检测结果准确、甜蜜素峰形好、线性范围广、良好的准确度和精确度，重复性、再现性好，可以满足槟榔中甜蜜素含量的检测，在槟榔行业中具有推广意义。