响应面法优化纤维素酶辅助提取山竹果皮中原花青素的研究

龚玉石，侯方丽，郭 娟，黎英权

（广东药科大学食品科学学院，广东广州 510006）

山竹（Garcinia mangostana L.），别名凤果、倒捻子，这种水果原产于马来群岛。其果肉中含有人体所需的多种营养，果皮占单果鲜质量的52%～68%，总体呈紫褐色[1]，其在化工、医药、食品等许多领域得到了运用，主要由于山竹含有原花青素、花色苷和氧杂蒽酮等多种活性成分，具有抗癌、抗氧化、镇痛消炎等多种功效[2-3]。

原花青素，广泛存在于植物界，是一大类多酚类化合物的总称，能够很好地帮助人体清除自由基，对高血压、肿瘤、衰老、炎症等起到抵抗作用，能够保护心血管甚至具有美容功效[4-5]，已被普遍应用于医药等多个领域。

很少有人研究山竹精加工工艺，人们通常直接食用山竹的果肉，而山竹果皮在整个果实中约占55%，通常将其视为精加工后的工业废料或者食用垃圾直接舍弃，这不仅对果皮中所含有的大量活性成分造成浪费，又引起了环境污染问题。国内外现阶段对原花青素的提取原料的研究大多为葡萄籽[6-7]、松树皮[8]、蓝莓[9]、苹果[10]、莲科植物[11-12]等。人们日益重视对山竹果皮的生物活性组成成分的研究。原花青素在山竹果皮中的含量很高[13]，因此在试验中选取山竹果皮作为提取材料，从而能对于其提取原花青素的工艺展开研究，对山竹果皮资源的开发具有一定意义，不但有利于开发富含原花青素新的材料，也可以变废为宝创造山竹果皮更高的经济效益，拓宽其应用领域。

目前，对山竹活性物质的纯化与分离还处于初级阶段，以山竹果皮为原料进行原花青素的提取工艺研究较少[14-17]，纤维素酶辅助对山竹果皮原花青素的提取相关工艺未见报道。在细胞壁的组成成分中，纤维素占有重要地位，葡萄糖与纤维二糖是其被纤维素酶分解之后的2个产物，试验为了提高其提取效率，借助纤维素酶来破坏、降解山竹果皮的细胞壁，从而溶出更多的细胞内容物。而针对响应面法优化纤维素酶辅助提取山竹果皮中原花青素进行研究，以期对相关研究起到一定的借鉴意义，从而有利于今后开展相关的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：新鲜山竹。

试剂：儿茶素标准品，中国药品生物制品检定所提供；C2H5OH，CH3OH，H2SO4，香草醛等，均为分析纯。

仪器：电热恒温鼓风干燥箱，上海中贤恒温设备厂产品；SL-1000型移液枪，德国Eppendorfer公司产品；HH-8型恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司产品；电子天平，北京联合科力科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂的配制

配制3%香草醛甲醇溶液：在100 mL的CH3OH中溶解已称量好的香草醛3.0 g。

配制30%硫酸甲醇溶液：在通风厨中，用量筒量取70 mL的CH3OH于烧杯中，然后在搅拌条件下，将30 mL 98%硫酸缓慢加入其中。

1.2.2 标准曲线的绘制

配制母液：精确称量20 mg的儿茶素对照品，用H2O溶解后移至20 mL的容量瓶中，摇匀备用。分别吸取母液 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL于10 mL容量瓶中，各自加H2O至刻度后摇匀。然后从这些样品中分别取0.5 mL移至10 mL比色管中，向其中加入2.5 mL的3%香草醛甲醇与30%硫酸甲醇溶液，于30℃下，避光反应15 min后，以去离子水作为空白，于波长500 nm处测定吸光度（Abs），然后作图，以质量浓度（mg/mL） 为横坐标、吸光度为纵坐标，得到Y=0.760 3X+0.002 8，相关系数R2=0.997 7的回归方程（X表示儿茶素质量浓度，Y表示吸光度）。

1.2.3 山竹果皮中原花青素提取率的计算

式中：C——根据标准曲线得出的原花青素的质量浓度，mg/mL；

V——提取液总体积，mL；

W——样品质量，mg。

1.2.4 山竹果皮原花青素提取的试验设计

（1）提取。样品制备：取0.2 g山竹果皮样品，捣碎后加入50 mL比色管中，加入适量纤维素酶与10 mL的H2O，保持反应温度不变，进行一段时间的水浴酶解后，将适量的C2H5OH加入其中，在一定的温度下进行一段时间的水浴提取，过滤后在50 mL容量瓶中用提取溶剂定容，备用。

采用硫酸-香草醛法[18-19]测定原花青素在样品中的含量：进行空白调零，即将0.5 mL样品用等量水替代，然后逐步加入2.5 mL香草醛甲醇与2.5 mL硫酸甲醇溶液，避光处理，于30℃下进行15 min的反应。吸取0.5 mL样品至比色管，加入2.5 mL香草醛甲醇与2.5 mL硫酸甲醇溶液，避光处理，于30℃下进行15 min的反应，于波长500 nm处测定吸光度A1。对于波长500 nm处的光提取液中的色素也可以吸收，所以将2.5 mL的香草醛甲醇与等量的甲醇溶液加入到0.5 mL的样液中，进行相同反应步骤测定吸光度A0，则原花青素的吸光度为A=A1-A0[13]，由此能够对样品颜色、本底造成的误差进行消除。然后以原花青素标准曲线为依据对提取率进行计算。

（2）单因素试验。在保证其他条件相同的情况下改变其中的一个条件，分别考查纤维素酶添加量1%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%，20%；乙醇体积分数50%，60%，70%，80%，90%；酶解温度35，40，45，50，55，60，65，70℃；酶解时间 10，20，40，60，80，100，120 min；提取时间 10，20，30，40，50，60，70 min；提取温度40，50，60，70，80，90，100℃对山竹果皮中原花青素提取率的影响。

（3） 响应面优化试验。以Box-Behnken中心组合试验设计原理为依据，基于单因素试验，选取对山竹果皮原花青素的提取率影响最大的4个因素进行确定，然后借助响应面法来优化实际的提取条件。在试验过程中采用Design Expert V8.0.6软件完成回归分析。试验分别选取了纤维素酶添加量、酶解温度、提取时间和酶解温度这4个单因素作为优化对象。

Box-Behnken设计因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

表1 Box-Behnken设计因素与水平

2.1.1 纤维素酶添加量对原花青素提取率的影响

纤维素酶添加量对原花青素提取率的影响见图1。

图1 纤维素酶添加量对原花青素提取率的影响

由图1可知，原花青素的提取率先随着纤维素酶添加量的增加而随之上升，在14%左右获得最大提取率，之后原花青素的提取率反而随着纤维素酶添加量增多而减小，这可能是因为随着纤维素酶添加量的提升，纤维素酶的添加量处于过饱和状态，使得原花青素的提取率降低。

2.1.2 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响

乙醇体积分数对原花青素提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响

由图2可知，原花青素的提取率先随着乙醇体积分数的增大而增大，在80%左右达到提取率最大值，之后原花青素的提取率反而随着乙醇体积分数的增大而减小。分析原因，可能由于过高体积分数的乙醇对纤维素酶的活性造成了抑制，不利于原花青素的浸出。

2.1.3 酶解温度对原花青素提取率的影响

酶解温度对原花青素提取率的影响见图3。

由图3可知，在酶解温度35～60℃时，原花青素的提取率随着酶解温度升高而增大，最大值在60℃处获得，之后呈下降趋势，这可能是因为酶解温度升高使得纤维素酶部分或全部变性，酶促反应受到抑制，不利于原花青素的浸出与提取。

2.1.4 酶解时间对原花青素提取率的影响

图3 酶解温度对原花青素提取率的影响

酶解时间对原花青素提取率的影响见图4。

图4 酶解时间对原花青素提取率的影响

由图4可知，原花青素的提取率在10～40 min内随着酶解时间延长而提高，主要由于延长酶解时间能够充分利用酶的活性，使得酶解反应较完全，山竹果皮的细胞壁在这个过程中得到的破坏不断加大，使其中原花青素成分不断溶出，从而更好地提高提取率。酶解一定时间后，已经几乎全部溶出了原花青素成分，提取率随着酶解时间延长而降低，所以最佳酶解时间为40 min。

2.1.5 提取时间对原花青素提取率的影响

提取时间对原花青素提取率的影响见图5。

图5 提取时间对原花青素提取率的影响

由图5可知，原花青素的提取率会随着提取时间延长而提高，最大值在30 min处获得，之后呈下降趋势。主要原因是由于提取时间不足时，没有溶出原花青素，但提取时间过长时原花青素的结构可能受到破坏，会溶出部分杂质成分。因此，最佳提取时间选为30 min。

2.1.6 提取温度对原花青素提取率的影响

提取温度对原花青素提取率的影响见图6。

图6 提取温度对原花青素提取率的影响

由图6可知，原花青素的提取率在一定温度区间内与提取温度成正比，最大提取率在70℃获得。提取温度升高，提取率却随之减小，主要由于过高的温度会使得其化学结构遭到一定的破坏。所以，最佳提取温度为70℃。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面分析方案及结果

通过单因素结果分析可知，纤维素酶添加量、酶解温度、提取时间和酶解时间这4个因素对山竹果皮原花青素提取率的影响最大。所以，借助Design Expert V8.0.6软件对这4个因素进行四因素三水平试验。

响应面分析试验设计及结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果

将表2中的数据进行回归分析，最终可得到如下多元二次线性回归方程式，其反映了各因素在回归拟合后对于山竹果皮中原花青素提取率Y的影响：

式中：首先要对其中的纤维素酶添加量X1、酶解温度X2、提取时间X3和酶解时间X4等4个变量进行量纲一线性编码处理，使得其绝对值大小与影响程度间存在直接联系，而正负则代表影响的方向性[13]。由于式中各二次项系数均为负值，因此方程一定有极大值点，故而对方程进行优化分析。得出结论为酶解温度、酶解时间、纤维素酶添加量与提取时间等4个变量对山竹果皮中原花青素影响率的影响程度依次递减。同时观察各项系数的绝对值可知，其中的酶解温度线性项、纤维素酶用量和酶解温度的交互项，以及各因素的二次项对原花青素得率影响最大。为检验方程的有效性，对该模型进行方差分析和显著性检验。

回归模型的方差分析见表3。

表3 回归模型的方差分析

表3中对该模型进行了方差分析显著性检验，p值小于0.000 1，该模型达到极显著；失拟检验中的p值大于0.05，为不显著。模型总决定系数R2=0.964 4，即该模型能够对96%的试验数据变异现象进行解释，也即该模型对新数据的预测性极佳。

回归模型系数显著性检验见表4。

根据表4可知，试验因素与Y值间不止存在简单的线性关系，不同变量间的交互作用和二次项也对Y值存在较大影响。其具体表现为：所有二次项影响表现均为极显著，X2和X1X2影响表现为显著。

2.2.2 单因素交互作用及分析

对于因变量受到自变量的影响，能够从自变量和响应值绘制的三维图中观察到，其中两因素交互作用的显著程度随着等高线图越圆而越低。

纤维素酶添加量和酶解温度对提取率的交互影响见图7，纤维素酶添加量和提取时间对提取率的交互影响见图8，纤维素酶添加量和酶解时间对提取率的交互影响见图9，酶解温度和提取时间对提取率的交互影响见图10，酶解温度和酶解时间对提取率的交互影响见图11，酶解时间和提取时间对提取率的交互影响见图12。

图7显示了在提取温度（C） 与酶解时间（D）不变时，原花青素提取率受到纤维素酶添加量（A）与酶解温度（B） 的交互作用的影响。保持B不变，提取率随着纤维素酶添加量的增加呈现先大后小的趋势；保持A不变，提取率的变化趋势亦是如此。两者存在明显的交互作用，且在纤维素酶添加量为13%～15%时原花青素提取率最大。

表4 回归模型系数显著性检验

图7 纤维素酶添加量和酶解温度对提取率的交互影响

图8显示，纤维素酶添加量和提取时间对原花青素提取率的影响，可以看到在控制酶解温度和酶解时间2个变量不变时，可以完全不考虑提取时间这一影响因素。这与显著性分析的结果一致。

图9显示，不变的两因素为酶解温度和提取时间，主要研究原花青素提取率受纤维素酶添加量与酶解时间交互作用的影响。

图8 纤维素酶添加量和提取时间对提取率的交互影响

图9 （a） 显示，纤维素酶添加量不变时，随着酶解时间的增加，提取率反而表现出来降低的现象，也就是说，就原花青素提取率而言，A和D间的相互作用对其影响较小。

图10显示，不变的两因素为纤维素酶添加量与酶解时间，取变量酶解温度和提取时间进行研究，当酶解温度一定时，原花青素提取率随着提取时间延长的变化趋势为先增后减，而当提取时间不变时，提取率的变化趋势亦是如此。这就充分表明了这二者并不存在明显的交互作用。

图11显示，纤维素酶添加量与提取时间保持不变，对酶解时间和酶解温度进行调整，研究二者的交互作用是如何影响提取率的。酶解时间和酶解温度分别不变时，随着自变量增大，提取率表现出先增加后减小的现象。而二者之间的交互作用并没有明显的反映。

图9 纤维素酶添加量和酶解时间对提取率的交互影响

图10 酶解温度和提取时间对提取率的交互影响

图11 酶解温度和酶解时间对提取率的交互影响

图12 酶解时间和提取时间对提取率的交互影响

图12 显示，不变量为纤维素酶添加量与酶解温度，提取时间和酶解时间改变。在图12（a）中，提取时间不变，提取率随酶解时间的增加先升高后降低；反之，当酶解时间不变时，提取率随提取时间的增加呈相同变化趋势。总体上这2种因素交互作用影响不大。

2.2.3 最佳工艺条件的确定与验证

对于提取山竹果皮原花青素的工艺，其最适合的提取条件为纤维素酶添加量13.99%，提取时间30.14 min，提取温度70℃，酶解时间39.06 min，酶解温度59.57℃，乙醇体积分数80%，在这样的条件下，理论上提取率为25.52%，实际提取率为25.43%，二者相较，仅存在0.35%的误差。由此认为此模型能够适用于试验，确立的最佳条件具有较高的可靠性。

3 结论

首先选取了6种单因素进行试验，在选取的过程中主要根据其可能对山竹果皮中原花青素的提取率产生影响的单因素，并分别探索其中的影响程度。结果表明，在纤维素酶添加量14%，提取时间30 min，提取温度70℃，酶解时间39 min，酶解温度59.5℃，乙醇体积分数80%条件下，获得最大提取率，但是最佳提取条件并非简单的各因素最佳值的结合。鉴于试验的可行性，从中选取了纤维素酶添加量、酶解时间、酶解温度、提取时间这4项对提取率影响最大的单因素进行响应面优化分析。

制定四因素三水平的方案，然后经过相应的回归拟合处理，得到响应值为Y的回归方程。由方程一次项系数知道，酶解温度、酶解时间、纤维素酶添加量、提取时间对提取率的影响逐渐减小。再观察其他项可知，酶解温度、酶解时间、纤维素酶用量、提取时间这4个因素的二次项对提取率的影响均表现为非常显著；而在较大程度上影响提取率的因素为酶解温度、纤维素酶添加量和酶解温度的交互作用。

最后，利用Box-Behnken中心组合试验设计，对于山竹果皮提取原花青素的工艺，其最佳的提取条件为纤维素酶添加量13.99%，提取时间30.14 min，提取温度70℃，酶解时间39.06 min，酶解温度59.57℃，乙醇体积分数80%，在这样的条件下，理论上提取率为25.52%，实际提取率为25.43%，二者相较，仅存在0.35%的误差。由此认为此模型能够适用于试验。另外，与没有添加纤维素酶的实际提取率17.38%[13]相比，山竹果皮中原花青素的提取率提高了约8%。

原花青素在山竹果皮中的含量丰富，将提取材料选为果皮不仅充分利用其经济价值，也增添了新的材料来提取原花青素。在传统提取工艺中添加纤维素酶，能够在很大程度上提高原花青素提取率，也为今后的相关工艺起到一定的借鉴意义。