调控基因hptRSA突变与甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌对磷霉素耐药相关性研究

王 珏， 徐 溯， 吴 湜， 杨 洋， 刘 杨

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（金葡菌）（MRSA）是重要的医院感染病原体之一，且近年逐渐向社区蔓延[1]。万古霉素是治疗MRSA侵袭性感染的一线用药，但万古霉素中介金葡菌（VISA）和异质性万古霉素中介金葡菌（hVISA）渐见增多[2]。磷霉素单独或联合用药成为治疗MRSA感染的一种选择[3]。然而，随着磷霉素的广泛应用，磷霉素耐药MRSA菌株也在临床出现，郭燕等[4]报道2010年我国MRSA磷霉素耐药率达到29.5% 。

磷霉素分子结构与6-磷酸葡萄糖（G-6-P）和3-磷酸甘油（G-3-P）类似，可分别通过两者的转运系统UhpT和GlpT转运进入胞质，继而与磷酸烯醇式丙酮酸转移酶（MurA）不可逆结合，抑制细菌细胞壁合成的初始阶段，杀灭细菌[5]。细菌对磷霉素耐药的常见机制包括：产生磷霉素修饰酶Fos；转运蛋白UhpT和GlpT变异；靶蛋白MurA变异等。本院前期研究表明磷霉素耐药MRSA菌株中fos基因和murA基因突变率很低，多数murA突变与磷霉素耐药无明显相关性，而glpT和uhpT突变率较高[6]。敲除uhpT和glpT基因可导致金葡菌对磷霉素耐药性升高，而菌株uhpT的转录水平似与其磷霉素敏感性相关[7]。

文献报道，uhpT的表达受hptRSA三组分调节网络的调控[8]，hptR、hptS、hptA3个基因构成了此调节网络，其中HptA可感知胞外G-6-P，激活下游hptRS系统，进而上调uhpT基因的表达；敲除hptRS基因后可引起细菌的磷霉素最低抑菌浓度（MIC）显著上升[9]。而hptA基因是否影响细菌磷霉素耐药性尚不明确；临床分离的MRSA中，hptRSA基因是否影响细菌磷霉素药敏亦不明确。本研究拟通过对复旦大学附属华山医院临床无菌体液分离的MRSA进行磷霉素MIC测定，检测耐药相关基因的突变，分析了解hptRSA基因变异在MRSA磷霉素耐药性形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2004－2014年我院住院患者血液和脑脊液分离得到的MRSA（剔除同一患者分离得到的重复菌株）共50株。其中血液40株，脑脊液10株。经纯分、16S rRNA测序及头孢西丁纸片法药敏鉴定确认为MRSA菌株后，甘油肉汤-80 ℃冻存。药敏测定质控菌株为金葡菌ATCC 29213。

1.1.2 主要试剂及仪器 胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、脑心浸液琼脂培养基（BHIA）和MH琼脂培养基为英国OXOID公司产品；磷霉素等抗菌药物标准品购自上海东方药品科技实业有限公司；G-6-P购自Sigma公司；溶葡酶、琼脂糖购自上海生工生物工程技术服务有限公司；金葡菌专用裂解液为上海市普陀区人民医院金姝医师专利产品（专利号：ZL201310124795.2）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；DNA抽提试剂盒、PCR试剂购自TaKaRa公司。PCR仪为美国ABI公司产品；A400多点接种仪、接种针和接种板为英国Denley公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药敏测定 以琼脂稀释法测定苯唑西林对50株MRSA的药敏，按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2017年标准判读[10]。磷霉素对50株MRSA的MIC测定和判断标准参照2019年欧洲共同体药敏试验委员会（EUCAST）标准（MIC≤32 mg/L为敏感折点）[11]。磷霉素MIC测定时，琼脂培养基中含25 mg/L的G-6-P。

1.2.2 DNA模板制备 挑取1～2个菌落，加入3 mL TSB过夜培养后，离心获得菌体沉淀，加入100 μL金葡菌专用裂解液及7 μL溶葡酶56℃金属浴50 min。根据TaKaRa DNA抽提试剂盒步骤提取细菌基因组DNA，获得的DNA抽提物稀释100倍用作fosB、glpT、uhpT、hptR、hptS及hptA基因的普通PCR模板。

1.2.3 磷霉素耐药相关基因序列分析fosB、glpT、uhpT引物及PCR条件参照傅祝英杰等[12]的前期研究。hptR、hptS及hptA引物为自行设计，使用NCBI primer-blast工具，根据GenBank金葡菌Newman菌株序列中hptR、hptS、hptA基因及周边序列设计引物，见表1。PCR扩增hptR、hptS、hptA基因，扩增产物进一步测序。PCR条件：所有基因94℃预变性5 min，退火30 s，延伸温度72 ℃，循环数35个。退火温度和延伸时间见表 1。测序后与 GenBank数据金葡菌Newman序列（Accession number：NC_009641）比对，确认变异位点，并将相应变异位点命名。变异位点命名逻辑参考Fu等[13]对uhpT和glpT基因变异的命名方式：变异位点若仅在磷霉素耐药株中出现，则依次使用英文字母命名为TypeA、TypeB、TypeC；变异位点若在磷霉素敏感株和耐药株中均存在，则使用罗马字母依次命名为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ；采用角标标注变异基因名称。

2 结果

2.1 药敏试验结果

5 0株M R S A的苯唑西林M I C值范围为3 2～2 5 6 m g/L。磷霉素的M I C值范围为1～＞1 024 mg/L；其中磷霉素耐药株34株，敏感株16株。耐药株多呈高水平耐药，21株MIC＞1 024 mg/L，3株MIC=512 mg/L，1株MIC=256 mg/L，3株MIC=128 mg/L。

表1 hptRSA PCR 引物及反应条件Table 1 PCR primers and reaction conditions used to amplify hptRSA genes in this study

表2 hptR、hptS、hptA 突变类型与相应菌株磷霉素MIC范围Table 2 Types of hptR，hptS and hptA mutation and fosfomycin minimum inhibitory concentration range

2.2 hptR 、hptS、hptA突变情况与磷霉素MIC

50株菌中，除所有同义突变外，hptR基因突变类型主要有3类，皆导致HptR肽链中单个氨基酸替代突变。hptS突变类型有6类，同样均引起HptS肽链中单个氨基酸替代突变。hptA突变类型有5类，其中TypeBhptA突变为hptA基因中932号碱基T删除，造成HptA肽链在第31位提前出现终止密码子；TypeChptA突变为hptA基因中405号碱基G突变为A，造成原先的189号密码子突变为终止密码子；余hptA基因突变均造成HptA肽链中单个氨基酸替代突变。每种突变类型的名称、具体的变异位点、突变率及磷霉素MIC见表2。hptR的TypeAhptR型突变，hptS的TypeAhptS、TypeBhptS、TypeChptS突变及hptA的TypeAhptA、TypeBhptA、TypeChptA突变仅在磷霉素耐药株中出现；而hptR的TypeⅠhptR、TypeⅡhptR突变，hptS的TypeⅠhptS、TypeⅡhptS、TypeⅢhptS型突变及hptA的TypeⅠhptA、TypeⅡhptA型突变在敏感株中亦有出现。50株菌中，hptR基因突变多表现为单位点突变，仅1株hptR基因出现TypeⅠhptR+TypeⅡhptR的突变组合。hptS基因多为多位点复合突变，有16株菌hptS基因出现TypeAhptS+TypeⅠhptS的突变，27株菌hptS基因出现TypeⅠhptS+TypeⅡhptS的组合。有7株菌hptA基因呈现多位点复合突变，其中5株菌hptA突变类型为TypeⅠhptA+TypeChptA，2株菌为TypeⅠhptA+TypeBhptA。hptRSA三个基因具体突变类型的组合所对应的菌株数量及MIC分布范围见表3。

表2 （续）Table 2（continued）

2.3 fosB 、glpT 和uhpT基因突变及磷霉素MIC

50株菌中，存在uhpT基因、glpT基因任一突变或fosB基因阳性的菌株共计31株，仅2株为磷霉素敏感株（MIC为2 mg/L），其余29株对磷霉素耐药，MIC分布于128～＞1 024 mg/L。31株菌中，uhpT突变有25株，皆为磷霉素耐药株，磷霉素MIC分布于128～＞1 024 mg/L；8株fosB基因阴性且glpT基因无突变，均为磷霉素耐药株，磷霉素MIC分布于128～＞1 024 mg/L。19株fosB基因阴性且glpT和uhpT无突变的菌株，磷霉素MIC分布于1～128 mg/ L，其中5株对磷霉素耐药，MIC分布于64～128 mg/L。fosB基因阴性且glpT无突变的菌株共计27株，磷霉素MIC分布于1～＞1 024 mg/ L。

2.4 hptRSA-uhpT突变类型与磷霉素耐药相关性

选取上述fosB基因阴性且glpT无突变的27株菌株，分析uhpT、hptRSA突变情况与磷霉素MIC相关性。

表3 hptRSA基因突变分布及对应菌株磷霉素MIC范围Table 3 Distribution of hptRSA gene mutation and fosfomycin minimum inhibitory concentration in MRSA isolates

这些菌株中uhpT突变类型有4类，分别为T904 插入、T27删除、第1073位碱基G被碱基T替代（G1073T）及第335位碱基G被碱基A替代（G335A）。8株携带有uhpT突变的菌株磷霉素MIC分布于128～＞1 024 mg/L。这8株菌中，uhpTT27删除的菌株有4株，其中有3株菌hptR、hptS及hptA基因均携带有各自TypeA型突变，MIC分布于256～512 mg/L，1株不携带TypeA突变菌株的MIC为128 mg/L。见表4。

19株fosB基因阴性且glpT和uhpT均无突变的菌株，磷霉素MIC分布于1～128 mg/L。在hptR和hptS基因突变类型分布一致的前提下，hptA基因存在突变的18株菌株中有6株菌的hptA基因突变类型为TypeIhptA+TypeChptA或TypeIhptA+TypeBhptA，磷霉素MIC分布于32～128 mg/L（2株MIC=128 mg/ L，3株MIC=64 mg/L，1株MIC=32 mg/ L），其余12株菌MIC分布于1～32 mg/ L（1株MIC 32 mg/L，1株MIC 16 mg/ L，其余10株MIC分布于1～8 mg/L）。见表4。

表4 fosB基因阴性、glpT基因无突变菌株中hptA基因突变与磷霉素敏感性关系Table 4 Correlation between hptRSA mutation and fosfomycin susceptibility in fosB(-)，wild-type glpT strains

3 讨论

金葡菌磷霉素耐药机制主要包括Fos修饰蛋白的产生，转运蛋白UhpT和GlpT突变，靶蛋白MurA突变等[7]。本课题组前期研究发现：磷霉素耐药金葡菌临床菌株中，磷霉素修饰基因和靶蛋白变异相对少见，却存在广泛的glpT和uhpT基因变异[12]。金葡菌标准株Newman敲除glpT或uhpT基因后，细菌对磷霉素耐药性明显增强（MIC分别上升8倍和64倍）[7]。有文献显示HptRSA蛋白可调控uhpT基因表达，继而影响菌株的磷霉素MIC[9]。近期研究显示当细胞外存在G-6-P时，HptA蛋白感知胞外G-6-P，激活HptRS系统，HptR与uhpT上游启动子区域结合，上调uhpT基因的表达，导致细菌对磷霉素敏感性升高[14]。本研究聚焦于hptRSA基因突变与磷霉素耐药之间的相关性，在临床无菌体液分离到的MRSA菌株中进行筛查，并分析这些突变对菌株磷霉素耐药性的影响。

本研究发现，我院2004－2014年无菌体液临床分离得到MRSA菌株中，68.0% （34/50）对磷霉素耐药。这些菌株中广泛存在hptRSA基因的突变，hptR的TypeAhptR型突变，hptS的TypeAhptS、TypeBhptS、TypeChptS突变及hptA的TypeAhptA、TypeBhptA、TypeChptA突变仅在磷霉素耐药株中出现，这几种突变类型可能与耐药有关。有超过半数（55.9%）的磷霉素耐药MRSA菌株同时携带TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型突变，且这些菌株对磷霉素多呈高水平耐药（MIC在256～＞1 024 mg/L，其中13株磷霉素MIC＞1 024 mg/ L）。同时，无论是否携带fosB基因、是否存在glpT基因突变，所有携带uhpT基因突变的菌株均为磷霉素耐药株，提示uhpT突变在磷霉素耐药中起到了重要的作用。而在fosB基因阴性、glpT基因无变异、下游uhpT突变类型相同的菌株中，TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型突变类型菌株磷霉素MIC是携带其他突变类型的菌株的2～4倍。由此推测TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型联合突变可能在下游基因uhpT存在突变的基础上进一步导致磷霉素MIC升高。

本次研究还发现，uhpT/glpT存在突变或fosB阳性的菌株中有90.3%（28/31）对磷霉素耐药，显著高于uhpT和glpT无突变且fosB阴性菌株（26.3%，5/19）。而在fosB基因阴性、glpT和uhpT基因均不存在突变的磷霉素耐药MRSA的菌株中，存在TypeBhptA或TypeChptA型突变株的6株菌MIC分布于32～128 mg/L，显著高于无上述2种突变的菌株。因此推测TypeBhptA型和TypeChptA型突变可单独介导磷霉素MIC耐药或临界耐药。

综上所述，HptRSA复合体的基因突变在临床分离磷霉素耐药MRSA菌株中并不少见；hptR、hptS和hptA三基因常同时发生某一特定类型联合突变可导致磷霉素高水平耐药；hptA单基因突变亦可能在MRSA磷霉素耐药形成中有重要作用。可继续行敲除及回补试验，以进一步确认hptA基因在介导MRSA磷霉素耐药中的作用。