奈诺沙星对脂多糖诱导炎性反应的免疫调控作用

赵 旭， 李 鑫， 张 菁， 郭蓓宁

喹诺酮类抗菌药物具抗菌谱广、抗菌活性强、不良反应少、组织渗透性强等特征，为治疗呼吸道感染、尿路感染等感染性疾病的常用抗菌药物，有环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等[1]。近年来开发了不含氟的新型喹诺酮类抗菌药物，且仍具有强大的抗菌活性，奈诺沙星是其中的代表[2]。它具有广谱抗菌活性，对各种革兰阳性菌和阴性菌、厌氧菌及非典型病原体均有良好抗菌作用[3]。目前该药已经上市。

近年来对抗菌药物的研究显示，抗菌药物一方面可以直接对病原菌起到杀菌或抑菌作用，另一方面也可通过调节宿主免疫功能清除病原菌，保护宿主的重要脏器功能[4]。国内外研究发现，氟喹诺酮类抗菌药物对宿主的非特异性和特异性免疫均有调控作用。如加替沙星能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用并提高细胞内杀菌能力[5]。在脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症小鼠模型中，环丙沙星可以抑制宿主产生的肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6等炎症前细胞因子，从而抑制LPS诱导的炎性反应[6-7]。然而，本研究以奈诺沙星为研究对象，采用体外细胞学实验和体内动物实验来研究奈诺沙星对LPS诱导炎性反应的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 RAW264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞系，购自美国Thermo Fisher公司。

1.1.2 试剂 奈诺沙星标准品由浙江医药提供；DMEM培养液（高糖）购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素双抗、LPS 、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；类胎牛血清购自美国HyClone公司；96孔酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国Bio-Rad公司。

1.1.3 实验动物 C57BL/C小鼠50只，鼠龄8～10周，体质量20～25 g，雄性，合格证号为SCXK（沪）：2017-0002，购自上海斯莱克实验动物有限公司。小鼠饲养温度18～25℃，相对湿度50%～70%。

1.2 方法

1.2.1 体外细胞学实验方法 自-80℃冰箱中取出RAW264.7细胞，加入含10%胎牛血清的高糖培养基（含青霉素、链霉素双抗），在37℃、5%CO2培养箱中培育至生长约80%传代，取4～5 代生长状态良好的细胞，以5×105/mL的密度接种于12孔板中培育至约80%进行LPS诱导炎性反应。在实验当天吸去细胞培养基随即加入新鲜的无血清DMEM培养基后孵育2 h，然后按不同组别加入奈诺沙星、LPS进行孵育。实验分为4组，组1：奈诺沙星+LPS组，先将400 μg/mL奈诺沙星溶液20 μL加入2 mL细胞培养基（奈诺沙星终浓度为4 μg/ mL），2 h后再加入1 μg/mL LPS 20 μL（LPS终浓度为10 ng/mL）继续培养；组2：LPS组，仅加入1 μg /mL LPS 20 μL；组3：奈诺沙星组，仅加入400 μg/mL奈诺沙星20 μL；组4：空白对照组，不加奈诺沙星和LPS。在加入LPS后3 h、6 h、12 h、24 h分别收集4组的细胞培养上清液置-80℃保 存。

1.2.2 低剂量LPS诱导小鼠内毒素血症模型及奈诺沙星干预 将30只小鼠随机分为6组，每组5只。组 1：奈诺沙星10 mg/kg+LPS组，在实验当日小鼠腹腔注射奈诺沙星10 mg/kg，2 h后腹腔注射LPS 5 mg/kg；组2：奈诺沙星40 mg/kg+LPS组，小鼠腹腔注射奈诺沙星40 mg/kg，2 h后腹腔注射LPS 5 mg/ kg；组3：奈诺沙星10 mg/kg组，只注射奈诺沙星10 mg/kg，不注射LPS；组4：奈诺沙星40 mg/ kg组，只注射奈诺沙星40 mg/kg，不注射LPS；组5：LPS组，只注射LPS，不注射奈诺沙星；组6：空白对照组，不注射LPS和奈诺沙星。在注射LPS后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h每组小鼠均眼眶取血，并立即离心取血清，置于-20℃保存。

1.2.3 细胞因子检测 采用ELISA 方法测定上述细胞培养上清液和小鼠血清中IL-6、IL-10以及TNF-α含量，按照ELISA试剂盒操作说明书进行检 测。

1.2.4 奈诺沙星对高剂量LPS致小鼠死亡的保护作用 20只小鼠随机分为4组，每组5只。组 1：LPS 12.5 mg/kg组，每只小鼠腹腔注射LPS 12.5 mg/ kg，2 h后注射0.9% NaCl溶液，1次/12 h作为对照；组2：奈诺沙星+LPS 12.5 mg/kg组，每只小鼠腹腔注射LPS 12.5 mg/kg，2 h后腹腔注射奈诺沙星40 mg/kg，1 次 /12 h，用药和观察两组小鼠的死亡至72 h；组3：LPS 25 mg/kg组，每只小鼠腹腔注射LPS剂量改为25 mg/kg，余操作同组1；组4：奈诺沙星+LPS 25 mg/kg组，每只小鼠腹腔注射LPS剂量改为25 mg/ kg，余操作同组 2。

1.2.5 统计学处理 采用GraphPadPrism 5.0 进行死亡率作图和分析。数据整理后，实验数据计量资料以均数±标准差表示，两组之间计量数据的比较采用t检验，两组之间死亡率采用Fisher精确检验法。

2 结果

2.1 体外奈诺沙星对LPS诱导巨噬细胞产生炎性因子的干预

检测显示，LPS组和奈诺沙星+LPS组IL-6水平均随时间延长明显升高，其中12 h达最高峰。奈诺沙星+LPS组在3 h、6 h、12 h的 IL-6水平比LPS组低，其中3 h和6 h点两组差异有统计学意义（P=0.000 6和P=0.003 5）（图1A）。对TNF-α检测，奈诺沙星+LPS组在3 h TNF-α水平比LPS组明显降低，两组差异有统计学意义（P=0.007 9），但在6 h和12 h奈诺沙星+LPS组与LPS组基本相仿（图1B）。与IL-6和TNF-α等促炎细胞因子不同，IL-10系抑炎细胞因子，IL-10表达量越高对炎症的抑制作用越强。奈诺沙星+LPS组和LPS组的IL-10水平也随着时间延长而明显升高，在3 h时两组基本相似，但在6 h和12 h奈诺沙星+LPS组较LPS组IL-10水平明显升高，差异有统计学意义（P值分别为0.005和0.034）（图1C）。无论哪一种细胞因子，奈诺沙星组和空白对照组的细胞因子水平基本均为0，提示无LPS存在时，奈诺沙星本身对巨噬细胞无刺激或抑制作用。

图1 ELISA 方法测定4组巨噬细胞上清液中细胞因子含量Figure 1 Cytokine levels in macrophage supernatant determined by ELISA after different treatments

2.2 奈诺沙星对低剂量LPS诱导的小鼠内毒素血症的影响

在低剂量LPS（5 mg/kg）诱导小鼠内毒素血症模型中，无论LPS组、奈诺沙星10 mg/kg+LPS组或奈诺沙星40 mg/kg+LPS组，IL-6、TNF-α及IL-10水平均呈现先升高后降低的趋势。对于IL-6，LPS组与两组奈诺沙星+LPS组的水平均在1～3 h呈上升趋势，至3 h达最高峰，之后迅速下降，至12 h基本为0；在1 h和3 h，两组奈诺沙星+LPS组与LPS组基本相仿，但在6 h奈诺沙星10 mg/kg+LPS组及奈诺沙星40 mg/kg+LPS组IL-6水平较LPS组明显降低，且差异有统计学意义（P值分别为0.005和0.006）（图2A）。TNF-α水平峰值出现更早，在1 h即出现最高峰，之后迅速下降，至6 h基本为0；但在1 h和3 h，奈诺沙星10 mg/kg+LPS组及奈诺沙星40 mg/kg+LPS组较LPS组TNF-α水平明显降低，差异有统计学意义（1 h时P值分别为0.047和0.037，3 h时P值分别为0.022和0.021）（图2B）。三组IL-10水平均在1 h出现峰值，之后不断下降，至12 h基本为0；在1 h奈诺沙星10 mg/kg+LPS组及奈诺沙星40 mg/ kg+LPS组IL-10水平均较LPS组明显升高，差异有统计学意义（P值分别为0.005和0.002）；其中在1 h时奈诺沙星40 mg/kg+LPS组IL-10水平较奈诺沙星10 mg/ kg+LPS组更高，但差异无统计学意义（P=0.073）（图2C）；奈诺沙星40 mg/ kg+LPS组与10 mg/kg+LPS组在其余各时间点各种细胞因子水平基本相仿。与体外细胞学实验结果相似，两组奈诺沙星组与空白对照组检测到的细胞因子水平基本均为0，提示无LPS存在时，奈诺沙星本身对小鼠血清细胞因子水平无调控作用。

2.3 奈诺沙星对高剂量LPS致小鼠死亡的保护作 用

奈诺沙星+LPS 25 mg/kg组和LPS 25 mg/ kg组的小

鼠死亡率均为100%。奈诺沙星+LPS 12.5 mg/ kg组小鼠无死亡；LPS 12.5 mg/kg组在36 h有1只小鼠死亡，在60 h有2只小鼠死亡，总死亡率3/5，提示奈诺沙星对LPS引起的内毒素血症致小鼠死亡有保护作用。两组死亡率差异无统计学意义（P=0.080）。奈诺沙星+LPS 12.5 mg/kg组和LPS 12.5 mg/kg组两组生存曲线比较，见图 3。

图2 ELISA 方法测定6组小鼠血清中细胞因子含量Figure 2 Serum level of cytokines determined by ELISA in mice after different treatments

图3 注射高剂量LPS（12.5 mg/kg）后两组小鼠的生存率Figure 3 The survival rate of mice after treatment with LPS（12.5 mg/kg）alone and LPS+nemonoxacin

3 讨论

作为一种不含氟的新型喹诺酮类抗菌药物，奈诺沙星对于临床上治疗较为困难的耐药菌如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）、青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）、粪肠球菌等的抗菌作用优于其他喹诺酮类。既往对该药的研究主要集中在作用机制、抗菌活性、药动学和药效学等方面[8-11]，未涉及对宿主免疫系统的调控作用。

本实验采用体外细胞学实验和体内动物实验研究奈诺沙星对LPS诱导炎性反应的调控作用。体外实验选择巨噬细胞作为LPS诱导炎性反应的作用细胞，这是鉴于巨噬细胞构成机体防御病原微生物感染的第一道防线，在免疫应答中发挥重要作用。而且巨噬细胞通过识别、吞噬及抗原递呈清除抗原性异物，同时通过分泌TNF-α、IL-6 等炎性因子及IL-8 等趋化因子，促进急性期免疫反应，加速对病原体的清除[12]。对喹诺酮类体外免疫调节机制的研究中多有采用LPS诱导巨噬细胞这一感染模型[13-14]。而动物实验研究喹诺酮类对宿主免疫系统的调控作用，也常采用腹腔注射LPS诱导小鼠引起内毒素血症这一模型[15]。因为LPS无细胞结构，而引起的机体炎性反应强烈，抗菌药物对其没有作用，故而此模型非常适合应用于研究抗菌药物的免疫调控作用机制。

奈诺沙星的临床药动学结果显示，健康志愿者单次服用500 mg奈诺沙星后，血药峰浓度（Cmax）为5.91 µg/mL[16]，据此本研究选择细胞学实验奈诺沙星的浓度为4 µg/mL，与单剂口服奈诺沙星的Cmax基本相似。实验结果显示在无LPS诱导的情况下，奈诺沙星对巨噬细胞无作用。但是当LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生炎性反应，IL-6、TNF-α等前炎性因子明显升高时，奈诺沙星对这两种促炎因子均显示为抑制作用，而对IL-10抑炎因子则显示为促进作用。对氟喹诺酮类的其他品种也有许多体外实验的相关研究，但各种不同品种氟喹诺酮类对LPS刺激单核/巨噬细胞产生细胞因子的调控作用不完全相同。如5～20 μg/ mL的莫西沙星对LPS刺激THP-1 细胞产生的IL-8抑制作用达26%～40%，对TNF-α抑制作用达14%～51%，对IL-1β的抑制作用达50%～83%[17]。而本实验结果也显示奈诺沙星对促炎因子有抑制作用，对抑炎因子有促进作用。这一作用在抗感染治疗中可能具有积极意义。这是因为TNF-α等虽然能刺激单核巨噬细胞及其他细胞分泌趋化细胞因子，引起白细胞在炎症部位的聚集，从而吞噬或杀灭病原微生物。但过量的细胞因子常可导致过度免疫反应，如过量TNF-α分泌入血可引起多脏器和免疫系统的损害，而过量IL-6常作为内源性致热源引起宿主发热[18-19]。因此，奈诺沙星等喹诺酮类抗菌药物对LPS诱导巨噬细胞发生强烈炎性反应时能抑制IL-6、TNF-α等细胞因子的产生，可以在一定程度上抑制机体过度的免疫反应，保护宿主重要脏器功能。

动物实验的结果与细胞学实验结果类似，且在动物水平验证了奈诺沙星可以抑制LPS诱导的炎性反应，对机体有保护作用，同时能降低LPS引起的内毒素血症的死亡率。而奈诺沙星+LPS 25 mg/ kg组和LPS 25 mg/kg组，两组小鼠全部死亡，这可能由于LPS剂量过大，内毒素血症过于严重，奈诺沙星免疫介导作用不足以挽救小鼠生命。在奈诺沙星+LPS 12.5 mg/kg组，小鼠无死亡，而LPS 12.5 mg/kg组总体死亡3/5，由于本次动物实验样本量较小，两组差异无统计学意义（P=0.08），但结果仍可提示奈诺沙星能降低因LPS引起严重内毒素血症小鼠的死亡。其他氟喹诺酮类抗菌药物也有类似的免疫保护作用。如小鼠腹腔注射4.5 mg或6 mg环丙沙星，再注射1 mg LPS，小鼠无死亡 ，而LPS组小鼠死亡率为100%[7]。本研究低剂量实验结果显示，在无LPS诱导的情况下，奈诺沙星对宿主免疫系统无作用，但是当腹腔注射LPS无论奈诺沙星10 mg/kg+LPS或奈诺沙星40 mg/kg+LPS组小鼠血清中的IL-6（6 h）、TNF-α（1 h和3 h）水平均明显低于LPS组小鼠；而抑炎因子IL-10（1 h）则升高，高于LPS组。提示LPS致小鼠脓毒血症实验中，奈诺沙星对IL-6、TNF-α均显示为抑制作用，而对IL-10则显示促进作用。

以上研究结果显示，奈诺沙星作为一种新型不含氟的喹诺酮类抗菌药物，与许多氟喹诺酮类药物相似，除了抗菌作用外，对宿主感染具有免疫调节作用，而且此免疫调节作用是正向的、积极的，可以抑制宿主产生的过度免疫反应，这将有助于改善重症感染性疾病免疫功能，并可能提高疾病治疗的有效性。