平喘方对哮喘模型小鼠pDC/cDC通路的干预作用研究

1.南京中医药大学无锡附属医院 江 苏，无锡 2 14001 2.上海市中医医院

哮喘是小儿常见肺系疾病，中医认为哮喘的发生机制是“内有壅塞之气，膈有胶固之痰，外有非时之感，三者相合，闭拒气道，搏击有声，发为哮喘”[1]。平喘方是全国名老中医虞坚尔教授在徐氏儿科第三代传人朱瑞群教授临床经验基础上结合自身学术特点而创制的，该方立足于哮喘发病之本——“伏痰夙瘀”，标本兼治，宣肺降气以定其喘，化痰以治其本，兼化瘀以撼其根，以恢复肺之宣降功能，达到平喘之目的，临床疗效显著。前期研究发现，平喘方可以影响T细胞的分化，从而减轻气道炎症[2]，但是其具体作用环节尚不清楚。本实验旨在考察平喘方对哮喘模型小鼠树突状细胞（dendritic cell，DC）的两种亚型即浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）和传统DC（conventional DC，cDC）的平衡的干预作用，探讨其对T细胞分化的影响环节。

1 材料和方法

1.1实验动物 清洁级雄性BALB/c小鼠40只，4～6周龄，体质量16～18g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供 [实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016]，饲养于上海中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2014-0008]。所有小鼠均在室温22℃、湿度50%～70%的环境中饲养，自由饮水与进食。

1.2中药 由上海万仕诚国药制品有限公司提供。

1.3主要试剂和仪器 地塞米松购于上海信宜有限公司（批号：110302）；鸡卵白蛋白（ovalbumin，OVA）购于上海骏惠化工有限公司（批号：20120418）；ELISA酶联免疫试剂盒由RD公司进口分装（批号：20171205）；10%甲醛、TEMED及HE染色剂均购于国药集团化学试剂有限公司（批号：20120320、ST728、20170927）；山羊血清封闭液、DAB显色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、HRP标记的抗生物素抗体、电泳缓冲液、Marker、PBS缓冲液、二抗均购于碧云天生物科技有限公司 （批号：P0102、ST033、P0010、P0211、P0021A、P0067、ST-476、A0216）；47kDa 叉头蛋白 P3（forkhead box P3，FOXP3）抗体购于美国Epitomics公司（批号：20171101）；52kDa维甲酸相关孤儿受体（retinoid-related orphan nuclear receptor，RORγt）抗体购于美国 Millipore公司（批号：20171018）；Masson染色剂购于南京建成科技有限公司（批号：171615）；cDNA合成试剂盒购于Fermentas公司（批号：20171112）；Trizol试剂购于Invitrogen公司（批号：20170125）；Real-time PCR Mix购于美国ABI公司（批号：20170502）。

RM2235石蜡切片机购于Leica公司；BX51型荧光显微镜购于Olympus公司；ABI-7500型PCR仪为美国ABI公司产品；Mini PROTEAN 3 cell电泳仪为BIO-RAD公司产品；PS-9电转仪购于大连竞迈科技有限公司。

1.4方法

1.4.1动物分组及模型制备 将40只BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、地米组和平喘方组，每组10只。10%OVA致敏液由10g OVA、1g氢氧化铝、100mL蒸馏水配成，即配即用。除空白组外，其他3组小鼠按50mL/kg的剂量腹腔注射10%OVA致敏液，空白组腹腔注射相同剂量的0.9%氯化钠溶液，每2周1次，共注射2次。末次注射1周后，除空白组外，其他3组小鼠均以5g OVA+100mL蒸馏水配制的5%OVA进行致敏雾化，空白组采用0.9%氯化钠溶液进行雾化，每次40min，1次/d，共1周。

1.4.2药物制备 平喘方方剂组成：炙麻黄5g、苦杏仁 10g、炙甘草 5g、炙苏子 10g、莱菔子 10g、大桃仁10g、淡子芩10g等。药物参考李仪奎[3]《中药药理实验方法学》及临床实际应用的方法煎煮提取，第1次加13倍水旺火煮沸后，温火煮30min，将药液滤出；第2次加入11倍水旺火煮沸后，温火煮30min，将药液滤出。将2次滤液合并浓缩，加入适量95%乙醇，乙醇具体加入量依据公式V×60/（95-60）计算。冷藏静置24h后滤出，将滤液浓缩至流浸膏样，配制至生药浓度 5.33g·mL-1。

1.4.3给药方法 各组小鼠于致敏雾化当天开始用药，平喘方组按1.4.2中的浓度，以20mL/kg·d的剂量灌胃；空白组和模型组以等剂量蒸馏水灌胃；地米组以蒸馏水将地塞米松片配制成浓度为0.075mg·mL-1的溶液，按等剂量灌胃。

1.4.4气道炎症指标检测

1.4.4.1ELISA法检测小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎症因子的含量各组灌胃1周后处死小鼠，收集BALF，以ELISA法测定白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白细胞介素-23（interleukin-23，IL-23） 及转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的含量。

1.4.4.2Western blot检测小鼠肺组织中 RORγt、FOXP3的蛋白表达 各组灌胃1周后处死小鼠，分离右侧肺组织，采用Western blot检测肺组织中RORγt、FOXP3的蛋白表达量。

1.4.4.3Real-time PCR检测小鼠肺组织中吲哚胺-2，3-二氧化酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）、肿瘤坏死因子超家族4（tumor necrosis factor superfamily4，TNFSF4）的基因表达 各组灌胃1周后处死小鼠，分离右侧肺组织，以Real-time PCR检测肺组织中IDO、TNFSF4的基因表达。反应体系如下：将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系总体积50μL，具体组成如下：Real-time PCR Mix 32.0μL、IDO、TNFSF4、上下 游 引 物 各 0.5μL、TaqMan Probe0.5μL、ddH2O 14.5μL、cDNA 模板 2μL。反应条件：95℃ 5min；95℃15s，60℃45s（采集荧光），共40个循环。以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。引物均由上海捷瑞生物工程公司设计合成，序列见表1。

1.4.5气道重建指标检测 各组灌胃1周后处死小鼠，取左侧肺组织放入冻存管中，以10%甲醛固定，以备切片。将肺组织进行Masson染色，镜下检测胶原蛋白面积，以及支气管基底膜周长（perimeter of bronchial basement membrane，Pbm）、支气管壁面积（bronchial wall area，Wat）和气道平滑肌面积（airway smooth muscle area，Wam）。400倍光学显微镜下挑选3支有完整横断面的中小支气管，采用图像采集系统获取图像，以Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量Pbm、支气管总面积（Wat1）、管腔面积（Wat2）、平滑肌外缘内气道面积（Wam1）、平滑肌内缘内气道面积（Wam2），并用 Pbm 标准化，分别以（Wam1-Wam2）/Pbm和（Wat1-Wat2）/Pbm来计算气道平滑肌面积（airway smooth muscle area，WAm）和气道内壁面积（airway inner wall area，WAi）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，服从正态分布且方差齐的计量资料，组间比较采用方差分析及LSD多重比较，若方差不齐则先进行转换，再采用方差分析及LSD多重比较。相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组小鼠一般情况比较 空白组小鼠呼吸均匀，活动正常，毛皮顺滑干燥，二便正常，进食及饮水正常。模型组雾化激发后出现呼吸急促，腹肌抽搐，抓挠皮肤，二便失禁，毛发竖起、潮湿欠光泽，惊恐易激惹等现象，饮食及活动减少。平喘方组和地米组小鼠毛色稍顺，活动自如，平喘方组体重增加，地米组体重稍有减轻。

2.2各组小鼠肺组织病理学改变比较 空白组支气管壁结构完整光滑，细胞排列整齐，管腔内及管周未见明显异常表现。模型组支气管变形，管径变窄，呈现菊花样改变，管腔内有大量的炎性渗出物，管周有大量的炎性细胞浸润及堆积。地米组支气管壁结构完整，管周有少许的炎性细胞浸润。平喘方组支气管管径正常，管壁结构稍有破损，管腔内及管周有少许炎性细胞浸润。见图1。

2.3用药1周后各组小鼠BALF中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的含量比较 与空白组比较，模型组BALF中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 含量均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，地米组、平喘方组的 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 含量均减低（P＜0.05）。与地米组比较，除IL-17外，平喘方组其他指标均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1 各组小鼠肺组织病理切片（HE染色，400×）Fig.1 Pathological sections of lung tissue in each group(HE staining，400×)

表2 各组小鼠 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 的含量比较（±s）Tab.2 Comparison of the contents of IL-6,IL-17,IL-23 and TGF-β in BALF in each group(±s)

表2 各组小鼠 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 的含量比较（±s）Tab.2 Comparison of the contents of IL-6,IL-17,IL-23 and TGF-β in BALF in each group(±s)

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与地米组比较，△P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05；compared with dexamethasone group，△P＜0.05

13.91±11.3 6 114.31±2 8.31 * 2 3.94±14.61*#60.16±30.84*#△组别 n IL-6（ng·L-1） IL-17（pg·mL-1） IL-23（pg·mL-1） TGF-β（ng·L-1）空白组模型组地米组平喘方组10 10 10 1 0 4.85±2.42 83 .35±19.28*12.90±5.64*#32.3 7±23.19*#△2.97±1.2 8 48.13±7.36*16.03±8.99*#14.80±7.53*#7.46±4.61 121 .70±28.46*13.74±6.01*#35.16±15.35*#△

2.4用药1周后各组小鼠肺组织中RORγt和FOXP3的蛋白表达量比较 与空白组比较，模型组肺组织中RORγt蛋白表达量增高，FOXP3表达量减低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，地米组、平喘方组肺组织中RORγt蛋白表达量减低，FOXP3表达量增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与地米组比较，平喘方组RORγt和FOXP3蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、图 2。

2.5用药1周后各组小鼠肺组织中IDO和TNFSF4基因表达量比较 与空白组比较，模型组肺组织中IDO的基因表达量降低，TNFSF4的基因表达量增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，地米组、平喘方组肺组织中IDO基因表达量增高，TNFSF4基因表达量的基因表达量降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与地米组比较，平喘方组中的IDO、TNFSF4基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表3 各组小鼠肺组织中RORγt和FOXP3蛋白表达量比较（±s）Tab.3 Comparison of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group（±s）

表3 各组小鼠肺组织中RORγt和FOXP3蛋白表达量比较（±s）Tab.3 Comparison of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

0.78±0.15 0.43±0.10*0.65±0.10*#0.59±0.09*#组别 n RORγt FOXP3空白组模型组地米组平喘方组10 10 10 1 0 0.46±0.12 0.78±0.06*0.60±0.09#0.65±0.08*#

图2 Western blot检测各组小鼠肺组织RORγt和FOXP3蛋白表达Fig.2 Detection of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group by Western blot

2.6指标之间的相关性分析

2.6.1IL-17与RORγt、FOXP3之间的相关性分析

Pearson相关性分析提示，IL-17与RORγt呈正相关，与FOXP3呈负相关。见表5。

2.6.2IL-23 与 RORγt、FOXP3、TNFSF4 和 IDO 之间的相关性分析 Pearson相关性分析提示，IL-23与RORγt呈正相关，与FOXP3呈负相关；与TNFSF4呈正相关，与IDO呈负相关。见表6。

表4 各组小鼠肺组织中IDO和TNFSF4基因表达量比较（±s）Tab.4 Comparison of IDO and TNFSF4 gene expression of lung tissue in each group（±s）

表4 各组小鼠肺组织中IDO和TNFSF4基因表达量比较（±s）Tab.4 Comparison of IDO and TNFSF4 gene expression of lung tissue in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

0.26±0.17 1.3 2±0.29*0.52±0.18*#0.42±0.21#组别 n IDO TNFSF4空白组模型组地米组平喘方组10 10 10 1 0 1.84±0.42 0.41±0.07*1.5 3±0.62 # 1.2 1±0.57#

表5 IL-17与RORγt、FOXP3的相关性分析Tab.5 Analysis of correlation between IL-17 and RORγt,FOXP3

2.6.3RORγt与TNFSF4、IDO之间的相关性分析

Pearson相关性分析提示，RORγt与TNFSF4呈正相关，与IDO呈负相关。见表7。

表6 IL-23 与 RORγt、FOXP3、TNFSF4、IDO 的相关性分析Tab.6 Analysis of correlation between IL-23 and RORγt,FOXP3,TNFSF4,IDO

表7 RORγt与TNFSF4,IDO的相关性分析Tab.7 Analysis of correlation between RORγt and TNFSF4,IDO

2.6.4FOXP3与TNFSF4、IDO之间的相关性分析

Pearson相关性分析提示，FOXP3与TNFSF4呈负相关，与IDO呈正相关。见表8。

2.7用药1周后各组小鼠肺组织中胶原蛋白面积比较 与空白组比较，模型组、地米组、平喘方组的肺组织中胶原蛋白面积增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，地米组、平喘方组的肺组织中胶原蛋白面积减低（P＜0.05）。与地米组比较，平喘方组的肺组织中胶原蛋白面积差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 9、图 3。

表8 FOXP3与TNFSF4、IDO的相关性分析Tab.8 Analysis of correlation between FOXP3 and TNFSF4,IDO

表9 各组小鼠肺组织中胶原蛋白面积比较(±s，%)Tab.9 Comparison of collagen area of lung tissues in each group(±s，%)

表9 各组小鼠肺组织中胶原蛋白面积比较(±s，%)Tab.9 Comparison of collagen area of lung tissues in each group(±s，%)

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

组别n 胶原蛋白面积17.60±2.07 38.00±2.92 * 2 6.40±3.36*#29.00±3.39*#空白组模型组地米组平喘方组5 5 5 5

2.8用药1周后各组小鼠肺组织中WAm、WAi比较与空白组比较，模型组肺组织WAm和WAi均增大（P＜0.01），地米组WAm和WAi差异无统计学意义（P＞0.05），平喘方组 WAm 增大（P＜0.01），而 WAi差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，地米组、平喘方组的WAm和WAi均减小（P＜0.01）。与地米组比较，平喘方组小鼠肺组织中WAm和WAi差异无统计学意义（P＞0.05）。见表10。

3 讨论

自从1969年研究发现气道中嗜酸粒细胞的增多是由淋巴细胞介导以来，随着气道炎症学说的发展，辅助性T淋巴细胞Th1/Th2亚群比例和功能失衡成为哮喘的经典发病机制。Th17是一种特殊的T细胞功能群，由该群细胞分泌的前炎性因子IL-17而命名，可以调节自身免疫、炎症和黏膜的防御反应。IL-17可以促进嗜中性粒细胞的募集并促进组织炎症的发生。Th17细胞本身不会引起嗜酸性细胞增多，从而导致气道炎症，但是IL23-Th17细胞轴可以加强Th2细胞优势应答介导的气道炎症。Treg细胞是一类抑制性T细胞，其在维持免疫内环境稳态和调节效应T应答中发挥着重要的作用。Treg细胞与Th17细胞起源于同一前体细胞，FOXP3和RORγt分别是Treg细胞和Th17细胞的关键性转录因子及种系特异性标志[4]，而FOXP3和RORγt的平衡也决定T细胞的分化类型，两者均由TGF-β启动。DC是具有抗原递呈功能的专职抗原递呈细胞。气道内存在两类DC，cDC通过高度表达TNFSF4，刺激原始T细胞向Th2、Th17细胞的分化，发生免疫应答，促进气道炎症；而pDC高度表达IDO，刺激Treg细胞分化产生，调节肺部免疫耐受的形成[5]。

图3 各组小鼠肺组织中胶原蛋白面积（Masson染色，400×）Fig.3 Collagen area of lung tissue in each group(Masson staining，400×)

表10 各组小鼠肺组织中 WAm、WAi比较（±s，μm2·μm-1）Tab.10 Comparison of WAm and WAi of lung tissue in each group(±s,μm2·μm-1)

表10 各组小鼠肺组织中 WAm、WAi比较（±s，μm2·μm-1）Tab.10 Comparison of WAm and WAi of lung tissue in each group(±s,μm2·μm-1)

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01Note：Compared with blank group，**P＜0.01；compared with model group，##P＜0.01

17.69±2.3 4 33.57±6.83**20.22±7.17##22.11±3 .98##组别 n WAm WAi空白组模型组地米组平喘方组10 10 10 1 0 29.60±10.57 75.23±28.98**35.23±12.3 6##48.02±2 2.45**##

TNFSF4又名 OX40配体（OX40 ligand，OX40L）、糖 蛋 白 34 （glycoprotein 34，gp34）、CD134 配 体（CD134 Ligand，CD134L），是肿瘤坏死因子超家族成员之一，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表达于活化的细胞，如成熟DC、活化B细胞、血管内皮细胞等，与受体结合后，可以调节CD4+和CD8+T细胞的活化及增殖，促使Th0细胞向Th2、Th17细胞分化，并且可以延长免疫应答效应，抑制T细胞凋亡[6-7]。IDO是一种含铁血红素单体蛋白，可以促进CD4+T细胞转化为FOXP3+的Treg细胞，而且可以诱导致其快速活化，抑制IL-17的分泌[8-9]。Kumar等[10]认为通过IDO诱导并扩增Treg细胞是重建免疫耐受的经典途径。本研究相关性分析提示，TNFSF4可以正向调节RORγt，负向调节FOXP3，从而促使T细胞向Th17细胞转化，分泌IL-17及IL-23，促进气道炎症；而IDO负向调节 RORγt，正向调节FOXP3，促使 T细胞向 Treg细胞转化，加强免疫耐受。

古人认为痰饮为津液所化，与水同类，具有很强的流动性。若膈之“胶固之痰”随气而动，当痰气交阻于肺，碍肺气宣降，即发为哮喘。津血同源，二者之间相互资生、相互转化，病理上相互影响、相互传变，因此，痰和瘀易于互结。若痰瘀互结，可使痰饮难化，瘀血难除，固着于肺，致使哮喘反复发作，缠绵难愈。因此课题组认为痰气交阻是哮喘发作的关键，痰瘀互结是哮喘难治的重点。平喘方是虞坚尔教授立足于“伏痰夙瘀”的病机而创制的，由炙麻黄、苦杏仁、紫苏子、大桃仁、莱菔子、淡子芩、炙甘草等组成。方中炙麻黄宣肺平喘，苦杏仁降气平喘，两者相配一宣一降；紫苏子辛温，可以温散痰饮，使水上行；莱菔子长于降气祛痰定喘，与紫苏子相伍，亦是一宣一降，四药相合疏利痰气，迅速恢复肺之气机；大桃仁活血化瘀，撼哮喘之本，阻于痰瘀互结；黄芩佐制方中他药之温燥之性，使痰湿得化而不致伤及阴津。整方宣降通用，与肺之宣降功能同性相求，化痰与祛瘀同用，相辅相成。本研究发现，平喘方可以恢复pDC/cDC的平衡，促进IDO表达，抑制TNFSF4表达，进而促使T细胞向Treg细胞分化，从而影响Treg/Th17细胞的分化平衡，诱导免疫耐受，降低气道炎症；同时平喘方可以使哮喘模型小鼠的胶原蛋白面积、WAm和WAi减少，从而改善气道重建。

现代药理研究发现，麻黄中的主要成分麻黄碱有拟肾上腺素样作用，可通过释放递质发挥间接作用，也可以直接激动α及β-肾上腺素能受体，松弛支气管平滑肌，兴奋心肌，升高血压[11]。苦杏仁及大桃仁中含有苦杏仁苷，其可明显减少卵白蛋白致豚鼠哮喘模型的炎症细胞数量，抑制舒缩性介质和炎性因子水平的升高，从而能够镇咳平喘[12]。大桃仁还具有抗凝血、抗炎、抗过敏等作用[13]。紫苏子的成分紫苏油中的脂肪酸类具有抗过敏、抗炎功效，且其机制与抑制血小板活化因子和白细胞三烯（leucotriene，LT）产生有关；同时还能够抑制血小板聚集，防止血栓形成[14]。莱菔子中含有芥子碱，能够通过扩张气道平滑肌增加肺和气管容量[15]。黄芩的成分黄芩苷可以显著抑制白细胞内LTB4和LTC4的生物合成[16]，还能够抑制血小板聚集，抑制凝血酶诱导的纤维蛋白产生[17]。

综上所述，平喘方可以恢复pDC/cDC的平衡，诱导免疫耐受，降低气道炎症，同时还能改善气道重建。从现代药理看，该方中既有扩张支气管平滑肌的成分，又有抗过敏的成分，至于其作用于DC中的哪些具体靶点，作用机制如何，尚需进一步研究。