苏黄止咳胶囊中非挥发性成分的LC-MS 分析

刘芹燕， 巫兴东#， 陈 东， 李舒丰， 秦真程， 王 真， 谭宁华∗

（1.中国药科大学，中药学院中药制药系，天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京211198；2.扬子江药业集团北京海燕药业有限公司，北京102206）

苏黄止咳胶囊是晁恩祥教授根据多年临床经验，基于“风咳” 理论，研发而成的，2008 年经国家食品药品监督管理局批准上市的中药6 类新药，是目前唯一一个被批准用来治疗咳嗽变异型哮喘和感冒后咳嗽的中药制剂。其处方由9 味中药材组成，其中蜜炙麻黄、紫苏叶为君药；蝉蜕、地龙、五味子和炒牛蒡子为臣药；蜜枇杷叶和前胡为佐药；炒紫苏子为使药。

目前，对苏黄止咳胶囊的研究多集中在其临床应用［1-2］和药理活性方面［3-4］。其临床上的安全性和有效性已得到证实，动物试验研究亦表明具有止咳、抗炎、平喘、祛痰及免疫调节的药理作用［5］。苏黄止咳胶囊中单味中药化学成分及其生物活性研究较透彻，麻黄中的麻黄碱和伪麻黄碱具有平喘药理作用［6］；紫苏叶中主要为紫苏醛等挥发油成分，具有抗炎药理作用［7］，非挥发性成分主要为迷迭香酸和绿原酸，有抗炎作用［8-9］，另外绿原酸有免疫调节作用［9］；蝉蜕中多巴胺二聚体类成分具有抗炎药理作用［10］；地龙中次黄嘌呤和琥珀酸具有平喘药理作用［11］；五味子中主要为木脂素类成分，其中五味子甲素和五味子醇甲具有抗炎药理作用［12］；牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡子苷元具有止咳、抗炎药理作用［13］；枇杷叶中主要为熊果酸、齐墩果酸等三萜酸类成分，具有止咳、抗炎药理作用［14］；前胡中主要为白花前胡甲素，具有抗炎、平喘药理作用［15-16］；紫苏子中的迷迭香酸具有抗炎活性［8］。

但是苏黄止咳胶囊组方的系统化学成分的研究鲜有报道，质量控制方面也仅限于对盐酸麻黄碱和紫苏醛的含有量测定［17-18］，无法全面反映苏黄止咳胶囊的化学物质基础。前期课题组利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS） 对苏黄止咳胶囊及其中间体的挥发油成分进行系统分析［19］，本研究利用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS） 将对苏黄止咳胶囊中的非挥发性成分进行研究，以期为该药今后的质量控制、药效物质基础研究、功效阐明、临床指导合理用药和工艺优化等提供更多的科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 1 525 分析型HPLC、Waters-Xevo TQD液质联用仪（美国Waters 公司）；岛津LC-MS-IT-TOF（日本岛津公司）；SI-234 型电子分析天平［丹佛仪器（北京）有限公司］； BP211D 分析天平 （德国Sartorius 公司）；Grant XB-22 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；EYELA OSB-2100 旋转蒸发仪（上海泉杰仪器有限公司）。

1.2 试剂 新绿原酸 （7）、隐绿原酸 （9）、维采宁-2（11）、异鼠李素3-O-β-D-半乳糖苷（16）、罗汉松树酯酚（21）、戈米辛D（27）、五味子醇乙（28）、当归酰戈米辛H（30）、戈米辛G（34）、五味子酯乙（41）、五味子酚（43）、苯甲酰戈米辛O（49） 购自南京元宝峰医药科技有限公司；柠檬酸（1）、腺苷（2）、盐酸麻黄碱（4）、盐酸伪麻黄碱（5）、夏佛塔苷（13）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（18）、白花前胡甲素（37） 购自中国食品药品检定研究院。绿原酸（8）、迷迭香酸（17）、牛蒡苷（20）、牛蒡子苷元（24）、五味子醇甲（26）、五味子酯甲（40）、五味子甲素（45）、五味子乙素（47） 为实验室分离提取得到，经HPLC 检测，所有对照品含有量均≥95%。乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；甲醇（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；甲酸［分析纯，赛默飞世尔科技（中国） 有限公司］；水（纯净水，娃哈哈集团有限公司）；苏黄止咳胶囊由扬子江药业集团北京海燕药业有限公司提供。

2 方法

2.1 样品溶液制备 取胶囊3 粒，除去胶囊壳，研细混匀，取研磨后的粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL 锥形瓶中，加甲醇40 mL，室温下超声提取30 min，取出冷却至室温，加甲醇补足减失质量，摇匀，静置后过滤，残渣连同滤纸用甲醇洗涤3 次，每次3 mL，合并提取液和洗涤液置100 mL 圆底烧瓶中，减压浓缩至干，用甲醇溶解并转移至10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻线，摇匀，静置后取上清液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备 分别称取对照品适量，加甲醇配成适当浓度的对照品贮备液，分析前再分别取适量配成混合对照品溶液。

2.3 色谱条件 Ultimate Plus C18色谱柱（4.6 nm×250 nm，5 μm）；流动相0.01%甲酸水（A） -乙腈（B），洗脱梯度（0～10 min，5%B；10～20 min，5%～15%B；20～60 min，15%～30% B；60 ～80 min，30%～40% B；80 ～115 min，40%～70% B；115 ～125 min，70%～100% B）；体积流量（0～60 min，0.8 mL／min；60 ～80 min，0.8 ～1.0 mL／min；80～125 min，1.0 mL／min）；检测波长205 nm；进样量10 μL。

2.4 质谱条件

2.4.1 Waters-Xevo TQD 液质联用仪 电喷雾（ESI） 电离源；正负离子模式全扫描；扫描范围m／z 50 ～1 500；氮气体积流量700 L／h；脱气温度450 ℃；毛细管电压3.0 kV（ESI+），1.5 kV（ESI-）；毛细管温度500 ℃；喷雾电压3 kV；锥孔电压40 V；雾化气体积流量650 L／h；辅助气体积流量50 L／h；碰撞能量32 V；三分通流2 ∶1。

2.4.2 岛津LCMS-IT-TOF 电喷雾（ESI） 电离源；正负离子模式全扫描；扫描范围m／z 100 ～1 000；毛细管电压4.5 kV（ESI+），3.5 kV（ESI-）；毛细管温度200 ℃；喷气体积流量1.5 L／min；干燥气压力104.0 kPa；检测器电压1.58 kV；碎裂方式为碰撞诱导解离（CID）；碰撞能量50%。

3 结果

苏黄止咳胶囊提取液的液相色谱图和正、负离子模式下的总离子流图见图1，所有化合物的结构见图2，所鉴定的化合物的保留时间、分子式、质谱数据和药材来源归属见表1，其中表中的一级质谱数据由Waters-Xevo TQD 获得，多级质谱数据由LCMS-IT-TOF 获得。共分析和鉴定出50 个化合物，包括4 个生物碱、8 个酚酸、5 个黄酮、2 个香豆素、29 木脂素和2 个其他类型化合物，其中有27 个化合物和对照品进行对照确认，另外对检测到的化合物的裂解途径进行了总结。

图1 苏黄止咳胶囊液相色谱图与总离子流图

图2 化合物结构式

表1 化学成分鉴定

续表1

续表1

续表1

3.1 生物碱类 通过质谱碎片分析及对照品保留时间比对，共有4 个生物碱类化合物（3 ～6） 在正离子模式下被鉴定出，均来自麻黄，主要裂解途径为丢失一分子水。

通过和对照品对照后，化合物4～5 分别确定为麻黄碱和伪麻黄碱。以麻黄碱（4） 为例，其裂解途径见图3。其准分子离子峰均为m／z 166［M+H］+，一级质谱中均有明显的脱水峰m／z 148［M+H-H2O］+，然后在二级质谱中分别失去一分子甲基和氨甲基后形成m／z 133［M+H-H2OCH3］+和m／z 117［M+H-H2O-CH3NH2］+的碎片离子。化合物3 和6 的准分子离子峰为m／z 152［M+H］+和m／z 180［M+H］+，分别比麻黄碱少一分子甲基和多一分子甲基。因此，化合物3 和6 推断是去甲基（伪） 麻黄碱和甲基（伪） 麻黄碱［25］。

3.2 酚酸类 共8 个酚酸类化合物（7～10、12、15、17～18） 在负离子模式下被鉴定出来。其中，有5 个化合物通过和对照品的保留时间和质谱数据对照后确认，分别是新绿原酸（7）、绿原酸 （8）、隐绿原酸 （9）、迷迭香酸（17） 和4，5-二咖啡酰奎宁酸（18），这类化合物主要裂解途径为酯基的酰氧键断裂。

化合物7～9 和18 的结构类似，具有相似的裂解途径。以隐绿原酸（9） 为例，其裂解途径见图4。隐绿原酸在负离子模式下的准分子离子峰为m／z 353［M-H］-，隐绿原酸结构中C-4 位连有一个咖啡酰基，很容易先生成m／z 191［quinic-H］-的碎片离子，然后再脱水生成m／z 173［quinic-H-H2O］-的基峰碎片离子［49］。隐绿原酸的二级质谱中还有m／z 179［caffeic-H］-的碎片离子，然后再失去一分子CO2生成m／z 135［caffeic-H-CO2］-的碎片离子。

图3 麻黄碱裂解途径

图4 隐绿原酸裂解途径

化合物15 的准分子离子峰为m／z 521［M-H］-，二级质谱中的基峰为m／z 359［M-H-162］-，推测可能失去一分子葡萄糖，三级质谱中，进一步裂解生成m／z 197 和161的碎片离子，和迷迭香酸（17） 的碎片离子一致，推测化合物15 可能是迷迭香酸苷［36］。

化合物10 的准分子离子峰为m／z 337［M-H］-，二级质谱的基峰为m／z 191［quinic-H］-。推测化合物10 可能是肉桂酰奎尼酸［29-30］。

化合物12 在正离子模式下有2 个加合离子峰，分别为m／z 349［M+Na］+和m／z 365［M+K］+，负离子模式下的准分子离子峰为m／z 325［M-H］-，可推测此化合物的分子量为326。二级质谱中，m／z 325 的离子生成m／z 163［M-HGlc］-和m／z 119［M-H-Glc-CO2］-的碎片离子。通过和文献中的质谱数据对比后［30］，化合物12 推测为nebrodenside B。3.3 黄酮类 一共5 个黄酮类化合物（11、13 ～14、16、25） 在负离子模式下被鉴定出来，其中化合物11 和13 为黄酮C-苷，化合物14、16 和25 为黄酮O-苷。这些化合物主要来自麻黄和枇杷叶。

3.3.1 黄酮C-苷 这类化合物的主要裂解途径为失去60、90、120 Da 等碎片［50］。通过和对照品对照，化合物11、13确定是维采宁-2 和夏佛塔苷。以夏佛塔苷（13） 为例，其裂解途径见图5。夏佛塔苷的准分子离子峰为m／z 563［MH］-，在二级质谱中生成m／z 503［M-H-60］-、m／z 473［M-H-90］-、 m／z 443［M-H-120］-、 m／z 383［M-H-120-60］-和m／z 353［M-H-120-90］-的碎片离子。三级质谱中，m／z 353 的离子通过连续失去CO 生成m／z 325［M-H-120-90-CO］-和297［M-H-120-90-2CO］-的碎片离子。

3.3.2 黄酮O-苷 黄酮O-苷主要裂解途径为失去葡萄糖或半乳糖（162 Da） 或鼠李糖（146 Da）［51］。化合物16 通过和对照品对照后确认为异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷，可能的裂解途径见图6。异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷的准分子离子峰为m／z 477［M-H］-，二级质谱中生成m／z 462［M-H-CH3］-、m／z 315［M-H-162］-、m／z 300［M-H-162-CH3］-、m／z 299［M-H-162-CH3-H］-、m／z 271［M-H-162-CH3-H-CO］-和m／z 255［M-H-162-CH3-H-CO2］-的碎片离子。其中基峰为m／z 299，是m／z 300 的碎片峰在高电离能下失去一分子H 而产生的。三级质谱中，m／z 299 的离子通过单独或连续中性丢失CO 和CO2生成m／z 271、255、227 和199 的碎片离子。基于相似的裂解途径并通过和文献中的质谱数据对比［35］，化合物14 推测为槲皮素-4′-O-β-D-半乳糖苷。

化合物25 的分子离子峰为m／z 577［M-H］-，二级质谱中有2 个特征性离子峰，分别为m／z 431［M-H-146］-和m／z 285［M-H-292］-，其中m／z 285 的碎片离子峰为基峰，与山柰酚的质谱碎片相同。化合物25 的洗脱时间明显比其它黄酮类化合物的洗脱时间长很多，和文献里的数据一致［43］，化合物25 推测是4″-trans-p-coumaroyl-kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside。

3.4 香豆素类 共2 个香豆素类化合物（36～37） 在正离子模式下被检测到，主要来自前胡。都属于3′，4′-二酰氧基取代开洛酮类香豆素，特征碎片离子为m／z 227［46］。

化合物37 通过和对照品对照后确认是白花前胡甲素，其裂解途径见图7。根据文献［46］可知，香豆素结构上的4′位取代基容易先脱去，然后再脱去3′位取代基。先是4′位失去中性碎片CH3COONa（82 Da） 生成m／z 327 的碎片离子，然后在3′位失去中性碎片C4H7COOH（100 Da） 生成m／z 227 的碎片离子，再通过凯林内酯骨架丢失CO 产生m／z 199 的碎片离子［52］。化合物36 和白花前胡甲素有相似的裂解途径，推测是白花前胡香豆精Ⅱ［46］。

图5 夏佛塔苷裂解途径

图6 异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷裂解途径

图7 白花前胡甲素裂解途径

3.5 木脂素类 29 个木脂素类化合物被鉴定出，其中有6个木脂素类化合物（19～24） 来自牛蒡子，23 个木脂素类化合物（26～35、38 ～50） 来自五味子。牛蒡子中的木脂素主要属于二苄基丁内酯型木脂素，比较容易在负离子模式下检测到，部分化合物也可以在正离子模式下检测到；五味子中的木脂素主要属于联苯环辛二烯类木脂素，均在正离子模式下检测到。

3.5.1 牛蒡子中的木脂素 这类木脂素都有相似的裂解途径，在正离子模式下主要脱去H2O，在负离子模式下主要脱去CH3和CO2。通过和对照品的保留时间和质谱数据对照后，化合物20～21、24 分别被鉴定为牛蒡苷、罗汉松树脂酚和牛蒡子苷元。以牛蒡苷（20） 为例，其裂解途径见图8。在正离子模式下的一级质谱给出了2 个加合离子m／z 557［M+Na］+和m／z 573［M+K］+，二级质谱中通过脱去一分子葡萄糖生成m／z 395［M+Na-Glc］+和m／z 373［M+HGlc］+的碎片离子，m／z 373 的碎片离子通过失去一分子水生成m／z 355［M+H-Glc-H2O］+的碎片离子，m／z 137 和m／z 237 的碎片离子是苄基的C7-C8 位键断裂后形成的，m／z 237 的碎片离子进一步脱水生成m／z 219 的碎片离子。负离子模式下的一级质谱给出了一个加合离子m／z 579［M+HCOO］-，二级质谱中通过失去HCOOH 生成m／z 533［MH］-的准分子离子峰，继续裂解生成m／z 371［M-H-Glc］-的碎片离子，然后再裂解分别生成m／z 356［M-H-Glc-CH3］-和m／z 312［M-H-Glc-CH3-CO2］-的碎片离子。

图8 牛蒡苷裂解途径

化合物19 比罗汉松树脂酚（21） 的分子量多162，应该是多一分子葡萄糖，推测19 是罗汉松树脂酚苷［39］。

化合物22～23 的正离子模式下有2 个加合离子m／z 559［M+Na］+和m／z 575［M+K］+，负离子模式下有一个准分子离子峰m／z 535［M-H］-，因此也可判断出其分子量均为536，且互为同分异构体。两者均有m／z 517［M-H-H2O］-、m／z 505［M-H-CH2O］-、m／z 502［M-H-H2O-CH3］-的碎片离子峰，根据文献中报道的关于它们在液相中的洗脱顺序［42］，可推测分别是异牛蒡酚A 和牛蒡酚A。

3.5.2 五味子中的木脂素 通过和对照品的保留时间和质谱数据对照，一共11 个木脂素（26～28、30、34、40～41、43、45、47 和49）。通过研究这几个化合物的质谱碎片和裂解途径，总结出这类木脂素的C-1、C-14 和八元环（C-6、C-7、C-8 和C-9） 是其活性部位，这些位置上的取代基比较容易脱去。由于在联苯环辛二烯类木脂素的苯环上存在很多甲氧基基团。因此，连续地丢失甲基和甲氧基是其主要裂解途径。由于位阻效应，C-1 和C-14 位的甲氧基基团活性较强，比较容易失去［53］。这类木脂素一般比较容易失去CH3（15 Da）、H2O（18 Da）、CH3O（31 Da）、C3H6（42 Da）、C2H4O（44 Da）、C5H10（70 Da）、C5H8O2（100 Da）、C7H6O2（122 Da） 和C6H10O3（130 Da）。

以当归酰戈米辛H（30） 为例，其裂解途径见图9。其一级质谱给出2 个加合峰m／z 523［M+Na］+和m／z 539［M+K］+，除此之外，一级质谱中还发现了m／z 483［M+HH2O］+和m／z 401［M+H-C5H8O2］+的碎片离子，分别是C-8位脱水和C-1 位脱去当归酸（100 Da） 而生成的。二级质谱中，m／z 401 的离子通过单独或连续失去H2O、CH3、CO和CH3O 中性碎片生成m／z 386、370、355、337、327、322和309 的碎片离子峰。

基于相似的裂解途径，化合物29、31 ～33、35、38 ～39、42、44、46、48、50 分别被鉴定出［45-48］。

3.6 其他化合物 化合物1 的一级质谱给出准分子离子峰m／z 191［M-H］-。二级质谱中，生成m／z 173［M-H-H2O］-和m／z 111［M-H-2H2O-CO2］-的碎片离子。通过和对照品对照后确认为是柠檬酸。

化合物2 的一级质谱给出准分子离子峰m／z 268［M+H］+。二级质谱通过失去一分子戊糖（132 Da） 生成m／z 136 的碎片离子。通过和对照品对照后确认是腺苷。

4 结论

图9 当归酰戈米辛H 裂解途径

本文采用液质联用技术建立了苏黄止咳胶囊中非挥发性成分的定性分析方法。采用该方法，分析和鉴定了苏黄止咳胶囊提取物中的50 个化学成分，并对这些化合物进行了药材来源归属。这些化合物中包括4 个生物碱、8 个酚酸、5 个黄酮、2 个香豆素、29 个木脂素和2 个其他类型化合物，其中27 个化合物通过和对照品对照后确认。鉴定出的化合物大部分为木脂素，主要来自五味子。该结果基本阐明了苏黄止咳胶囊的化学物质基础，以期为后续的质量控制和药效物质基础研究奠定基础。