甘草地上部分对慢性前列腺炎大鼠的影响

张 琳， 赵梓邯， 于冰莉， 崔 洁， 侯俊玲，3∗， 王文全，3

（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；3.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京100102）

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎［1］，用药历史悠久，市场需求量大，但一直以来大量地上部分未得到有效利用而废弃，造成资源浪费。研究表明，甘草地上部分中黄酮类成分含有量高，并有较好的药理活性，已从中分离得到61 个黄酮类化合物和7 个酚类化合物［2］；地上、地下部分中黄酮类成分HPLC指纹图谱差异很大，以前者叶中含有量更高［3］；该部分中黄酮类成分具有良好的抗氧化及抗炎活性［4］，尤其对前列腺炎有较显著的预防和治疗作用［5］。

前列腺炎是最常见的泌尿生殖系统疾病，会导致排尿不畅、尿液潴留、性功能障碍等症状，流行病学调查显示，慢性前列腺炎／慢性骨盆疼痛综合征在男性人群中的发病率高达2.5%～16%［6］，其病情大多与久坐、疲劳、禁欲纵欲、吸烟饮酒等多种因素有关。现代医学对慢性前列腺炎的发病机制存在广泛争议，多数学者认为可能是病原体感染、炎症、异常的盆底神经肌肉活动和免疫异常等共同作用的结果［7］，导致相关治疗十分困难。

本实验以甘草地上部分为研究对象，考察它对慢性前列腺炎大鼠的影响，既为前列腺炎临床治疗提供新的天然药物，又为甘草综合开发利用奠定理论基础。

1 材料

1.1 动物 清洁级健康雄性SD 大鼠40 只，体质量280 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，常规饲养，每天自由饮水进食， 动物合格证号SCXK （京）2016-0006。

1.2 试药 甘草地上部分于2016 年9 月采自甘肃省酒泉市瓜州县河东乡，经北京中医药大学王文全教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分。前列康（浙江康恩贝制药股份有限公司）；槲皮素（上海源叶生物科技有限公司）；角叉菜胶（北京索莱宝科技有限公司）；水合氯醛、羧甲基纤维素钠（天津市福晨化学试剂厂）；ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 仪器 FA2 004 N 型分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；Multiskan FC 型酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；RE-52 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；101-2AB 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；KH-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZN-02 型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；移液枪（德国Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1.1 甘草水提物 甘草地上部分打粉，以1 ∶10 料液比用去离子水煎煮2 次，每次1.5 h，趁热过滤，浓缩滤液，55 ℃下烘干，即得，4 ℃下保存备用。

2.1.2 甘草醇提物 按照课题组前期所得最佳工艺进行提取，并稍作调整。条件为70%乙醇，料液比1 ∶10，70 ℃下超声提取20 min，浓缩滤液，55 ℃烘干，即得，4 ℃下保存备用。

2.2 分组、造模与给药 40 只大鼠随机分为假手术组、模型组、水提组、醇提组、阳性组，每组8 只，适应性喂养1 周后在无菌条件下以10%水合氯醛麻醉，腹正中切口至腹腔，提出膀胱及两侧精囊。除假手术组大鼠注射等量生理盐水外，其余各组前列腺腹侧叶注入0.1 mL 角叉菜胶生理盐水溶液，注射后缝合肌肉、皮肤［8-9］。水提组大鼠灌胃给予1 g／kg 药物CMC-Na 溶液，醇提组大鼠灌胃给予1 g／kg药物CMC-Na 溶液，阳性组大鼠灌胃给予0.552 g／kg前列康CMC-Na 溶液，假手术组、模型组大鼠灌胃给予20 mL／kg 0.7%CMC-Na 溶液，每天1 次，连续30 d。

2.3 取样及指标检测 末次给药24 h 后麻醉大鼠，腹主动脉取血，处死，取前列腺、胸腺，吸干脏器表面液体和血液，称定质量并记录，计算脏器指数，并进行相关检测。2.3.1 血清PGE2、MCP-1、NF-κB 表达 血样放置4 h 后离心15 min，取血清，ELISA 试剂盒检测PGE2、MCP-1、NF-κB 表达。

2.3.2 前列腺组织病理变化 取出部分大鼠前列腺组织，10%甲醛溶液固定， 常规石蜡包埋切片， 进行HE、Masson、免疫组化染色，镜检观察其病理变化。

2.3.2.1 HE 染色［10］按照各给药组前列腺腺体组织病变程度，将其形态学变化分为3 个等级进行定量评价，对各项病理变化评分计算总和作为整体评分。主要从腺体形态、炎性细胞浸润、纤维组织增生程度3 个方面进行评价，评分标准如下。

腺体形态：腺上皮单层细胞结构完整，排列整齐，细胞呈柱状、立方形，腺体上皮向管腔内折叠形成皱襞——2分；腺上皮轻度增生，有损伤，腺体上皮皱襞减少——4分；腺上皮受损变形严重，腺上皮皱襞减少或无——6 分。

瑞安叹息了一声，用一只手拽起头发。“好吧，我明白了。只是要答应我，假如外星人打过来了，你会脱身后再来找我。”

炎症表现情况及炎性细胞浸润程度：腺腔偶见炎性细胞——2 分；腺腔中度炎性细胞浸润——4 分；腺腔充满炎性细胞，且伴有充血现象——6 分。

纤维组织增生程度：极少纤维组织增生——2 分；纤维组织增生程度较轻——4 分；腺体周围有大量纤维组织增生，包被腺体——6 分。

2.3.2.2 Masson 染色 通过Image-pro Plus 软件进行定量分析，通过计算阳性表达区域的光密度值来综合评价各组纤维组织增生情况。

2.3.2.3 免疫组化染色 通过Image-pro Plus 软件进行半定量分析，以平均光密度为指标评价大鼠前列腺组织中TNF-α 表达。

2.4 统计学分析 通过SAS 8.2 软件进行处理，组间比较采用方差分析。P＜0.05 表示有显著性差异。

3 结果

3.1 大鼠一般状况和解剖体征 图1 显示，给药期间大鼠体质量增长趋势一致，组间均无显著性差异（P＞0.05）；第2 周开始，模型组大鼠体质量增加程度略低于假手术组，可能是疾病给大鼠带来一定痛苦，导致其食欲降低，体质量增长稍慢。

图1 各组大鼠体质量变化

图2 显示，假手术组大鼠前列腺表面红润有光泽，腺体组织柔软且有弹性；模型组大鼠腺体发红、肿大；给药组大鼠腺体红肿现象均有一定程度改善，但水提组有3 只出现肝病变，其中1 只左侧腹腔出现瘤状物，醇提组有1只大鼠出现肝病变。

图2 各组大鼠解剖体征病变

3.2 脏器指数 图3 显示，模型组大鼠前列腺指数略高于假手术组，但各组之间无显著性差异（P＞0.05），水提组相对较低；模型组大鼠胸腺指数显著高于假手术组（P＜0.05），各给药组均有不同程度的降低，以水提组、醇提组更明显（P＜0.05），表明水提物和醇提物能有效降低胸腺指数。

3.3 MCP-1、NF-κB、PGE2 表达 图4 显示，模型组MCP-1、NF-κB、PGE2 表达显著高于假手术组（P＜0.05）；各给药组MCP-1 表达均有降低趋势，但无显著性差异（P＞0.05）；各给药组NF-κB 表达显著降低（P＜0.05），以水提组更明显；水提组、阳性组PGE2 表达显著降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠前列腺组织病理形态 图5 ～6 显示，假手术组大鼠前列腺组织腺体完整，腺上皮单层细胞结构完整，未见萎缩，细胞间质炎性细胞少，无纤维组织增生情况，腺腔内分泌物丰富；模型组大鼠前列腺腺体变形严重，腺体萎缩，腺上皮皱襞减少，有脱落、坏死现象，部分腺上皮呈乳头状增生，腺体间质炎性细胞浸润严重，有明显的水肿现象，腺腔内分泌物减少；阳性药组大鼠腺体变形有所改善，腺体间质炎性细胞浸润较模型组减轻，部分腺腔内无分泌物；水提组大鼠前列腺组织腺体完整，上皮细胞排列较为整齐，间质水肿明显减轻，炎症细胞和分泌物明显减少；醇提组大鼠前列腺组织完整，但仍可见前列腺腺体稍有变形，部分炎性细胞浸润严重，改善情况不如水提物组。

图3 各组大鼠前列腺（A）、胸腺（B） 指数

图4 各组MCP-1（A）、NF-κB（B）、PGE2（C） 表达

图5 各组大鼠前列腺组织病理形态（HE 染色，×200）

图6 各组大鼠前列腺组织病理评分

图7 显示，模型组大鼠前列腺组织纤维化程度高于假手术组，而甘草水提物组、醇提物组、阳性组大鼠有一定程度的缓解。

图7 各组大鼠前列腺组织病理形态（Masson 染色，×400）

3.5 TNF-α 表达 图8 显示，假手术组大鼠基本无阳性表达；模型组大鼠细胞质、腺上皮细胞中存在大面积阳性表达；水提组大鼠TNF-α 表达较模型组有很大程度减少，并且优于醇提组；醇提组大鼠TNF-α 表达较模型组稍有减少；阳性组大鼠与假手术组接近。图9 显示，模型组TNF-α 表达显著高于假手术组（P＜0.05），各给药组均能显著降低其表达（P＜0.05），并且水提物组优于醇提物组。

图8 各组TNF-α 表达（免疫组化染色，×400）

图9 各组TNF-α 表达

4 讨论

目前对慢性前列腺炎发病机制尚未明确［11］，国内外有多种建模方法，而本实验采用注射角叉菜胶溶液。结果显示，模型组MCP-1、NF-κB、PGE2 表达明显提高，腺体变形严重，腺上皮有脱落、坏死现象，腺体间质炎性细胞浸润严重，有明显的水肿、纤维化现象，表明模型建立成功。

MCP-1 是一种重要的单核细胞激活因子，可诱导炎症因子的表达，在多种炎症疾病评价中有重要参考价值；NFκB 是细胞胞浆中的反应转录因子，参与炎症中的免疫反应，其表达可引发多种炎症介质的产生，从而使炎症反应加剧；PGE2 在炎症过程中有致热作用，也可引发水肿，而炎症和水肿是导致前列腺炎患者尿路刺激症产生的主要原因之一；TNF-α 是重要的炎症因子，能诱导趋化因子产生，使上皮细胞和淋巴细胞表达黏附分子，导致组织细胞增生、组织损伤等病理变化［11］。本实验发现，甘草地上部分醇提物能明显降低血清NF-κB 表达，而水提物能明显降低NFκB、PGE2 表达，并在一定程度上降低前列腺组织中TNF-α表达，减轻炎性细胞浸润及纤维组织增生情况，并且效果优于醇提物。

综上所述，甘草地上部分水提物有较好的抗前列腺炎作用，但本实验发现部分大鼠出现肝病变，其潜在毒性有待进一步确认。因此，今后将对甘草地上部分进行系统的毒理学研究和安全性评价，为其资源合理开发利用提供理论指导。