利肝隆颗粒组分挥发油提取、β-环糊精包合工艺的优化

王红芳， 李国川， 陈层层， 桑雨梅， 徐贵涛， 施 靖

（1.河北中医学院，河北 石家庄050200；2.河北医科大学第四医院，河北 石家庄050011）

利肝隆颗粒收载于2015 年版《中国药典》 一部［1］，是由板蓝根、黄芪、茵陈、当归、郁金等8 味药材提取物组成的中药复方制剂，功效疏肝解郁、清热解毒，用于急、慢性肝炎，迁延性肝炎等肝脏疾病，方中挥发油有效成分多，具有降脂［2］、缓解肝内损伤性免疫反应［3］、抗氧化活性［4］。在利肝隆颗粒制备过程中，挥发油用乙醇溶解后喷入干颗粒，但由于该成分不稳定，极易氧化分解，故临床使用前易挥发与降解，从而导致药效降低。

目前，β-环糊精是一种较理想的药物载体，其结构稳定，内部空穴亲脂性强，适合脂溶性药物包合，并且在水中溶解度小，安全无毒，生产成本低，广泛应用于医药和食品行业［5-6］。因此，本实验通过该载体对利肝隆颗粒组分挥发油进行包合，并通过正交试验对其和提取工艺进行优化，以期为该成分稳定性提高提供理论技术指导。

1 材料

1.1 仪器 JJ-1A 数显测速电动搅拌机（金坛晨阳电子仪器厂）；FA2104B 电子分析天平（上海天美天平仪器有限公司）；BSA224S-CW 电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；QUANTA 250 扫描电镜（FEI 香港有限公司）；D8 advanceX 射线衍射仪（德国Bruker 公司）。

1.2 试药 郁金（产地广西，批号17083001）、当归（产地广 西， 批 号 17081301）、 茵 陈 （产 地 河 北， 批 号18020601） 均购自国药乐仁堂河北药业有限公司，由河北中医学院生药学教研室张丹老师鉴定为正品，均符合2015年版《中国药典》 一部规定。β-环糊精（山东西亚化学工业有限公司，批号B4147）。石油醚（天津市富宇精细化工有限公司，批号160408）。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取工艺

2.1.2 工艺优化 通过预试验及查阅文献［9-11］，选择加水量（A）、药材粒度（B）、蒸馏时间（C） 作为影响因素，挥发油收率作为评价指标，每个因素3 个水平，采用L9（34）正交试验。 因素水平、 结果、 方差分析分别见表1～3。

由表3 可知，各因素影响程度依次C（蒸馏时间） ＞A（加水量） ＞B（药材粒度），其中因素A、C 具有显著影响（P＜0.05），而因素B 无显著影响（P＞0.05）。结合表2 得出最优工艺为A3B1C3，即加水量12 倍，药材粒度≥2.5目，蒸馏时间8 h。

表1 提取工艺因素水平

表2 提取工艺试验设计及结果

表3 提取工艺方差分析

2.1.3 验证试验 根据规定比例称取3 种药材各3 份，按“2.1.2” 项下优化工艺进行验证试验，测得挥发油收率分别为0.59%、0.61%、0.60%，表明工艺稳定可行。

2.2 β-环糊精包合工艺

2.2.1 包合方法 精密称取适量β-环糊精于三口烧瓶中，加入适量纯化水充分溶解，得到饱和水溶液，烧瓶置于调至规定温度的恒温水浴锅中匀速搅拌，于旁边小孔缓慢滴加等体积无水乙醇稀释的混合挥发油，匀速搅拌至规定时间后停止，转移至具塞三角瓶中，放冷至室温后冰箱中冷藏24 h，抽滤，滤饼用纯化水洗涤3 次，再用3 倍挥发油量的无水乙醇分次洗涤，45 ℃恒温通风干燥，即得白色粉末状包合物。

2.2.2 包合物实际含油量测定 精密量取混合挥发油200 μL，置于干燥至恒重的称量瓶中，精密称定挥发油质量，计算密度，重复3 次，测得密度为0.898 3 g／mL。精密称取干燥后的包合物，加500 mL 纯化水至圆底烧瓶中，按“2.1.1” 项下方法测定，对所得包合物进行水蒸气蒸馏回收提取，加热使其沸腾并保持微沸状态2 h，收集挥发油［12］，精密称定，得实际含油量。

2.2.3 空白回收率测定 精密量取挥发油0.5 mL，称取适量β-环 糊 精 加 入 圆 底 烧 瓶 中， 加500 mL 水， 按“2.1.1” 项下方法测定，加热沸腾并保持微沸状态2 h，回收挥发油，计算空白回收率，公式为空白回收率= （实际测得挥发油质量／蒸馏前投入挥发油质量） ×100%，平行3次，测得3 个比例（1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10） 挥发油与β-环糊精的平均空白回收率分别为 95.20%、 95.50%、94.91%，无明显差异，故选择95.20%。

2.2.4 工艺优化 通过单因素试验及查阅文献［13-14］，选择包合温度（A）、搅拌时间（B）、挥发油与β-环糊精比例（C） 作为影响因素，包合物含油率［（包合物中挥发油质量／包合物总质量） ×100%］、收率［（包合物质量／环糊精和投入挥发油质量总和） ×100%］、包合率［（包合物中挥发油质量／投入挥发油质量与空白回收率之比） ×100%］ 作为评价指标，计算综合评分，公式为综合评分=包合物含油率×0.2+包合物收率×0.2+包合率×0.6。因素水平、结果、方差分析分别见表4～6。

表4 β-环糊精包合工艺因素水平

表5 β-环糊精包合工艺试验设计及结果

表6 β-环糊精包合工艺方差分析

由表6 可知，各因素影响程度依次为B（搅拌时间） ＞C（挥发油与β-环糊精比例） ＞A（包合温度），其中因素B 有显著影响（P＜0.05），而因素A、C 无显著影响（P＞0.05）。结合表5 得出最优工艺为A1B3C1，即包合温度35 ℃，搅拌时间90 min，挥发油与β-环糊精比例为1 ∶6。

其次，开始时对科研成果转化的奖励范围可以适当放宽，鼓励大家积极转化。当科研成果的质量越来越好、成果转化率有所提高后，可逐步缩小奖励范围，建立优质、精品奖励导向，引导大家将成果转化越做越好、越做越精。同时，可随着学校发展需求，适度调整奖励方向，重点奖励需要重点发展的学科方向。

2.2.5 验证试验 按“2.2.4” 项下优化工艺制备3 批β-环糊精包合物，进行验证试验，测得包合物含油率、收率、包合 率 分 别 为14.95%、 80.02%、 89.12%， 综 合 评 分72.47，表明工艺稳定可行。

2.3 包合物表征

2.3.1 TLC 法 称取包合物、β-环糊精各0.1 g，加入1.0 mL无水乙醇超声15 min，离心，取上层澄清液，作为供试液a、b；精密称取挥发油0.1 mL，无水乙醇等体积稀释溶解，作为供试液c；常温下将挥发油与β-环糊精混合，加入5 mL 无水乙醇超声溶解15 min，离心取上层澄清液，作为供试液d；取适量包合物，水蒸气蒸馏提取挥发油，收集后精密量取0.1 mL，无水乙醇等体积稀释溶解，作为供试液e。精密量取上述5 种供试液各10 μL，于硅胶G 薄层板点样，挥干无水乙醇后置于展开缸，以石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1） 混合液为展开剂展开，取出，晾干，喷5%香草醛浓硫酸溶液显色，105 ℃下烘干至斑点清晰［15-17］，结果见图1。

图1 包合物TLC 色谱图

由图可知，在包合物、β-环糊精中未见明显斑点，而在β-环糊精与挥发油混合物、挥发油、包合物中回收挥发油中斑点分布位置几乎一致，表明β-环糊精对挥发油进行包合后形成新物相，同时也表明包合工艺并未改变挥发油化学性质。

2.3.2 显微法 在显微镜下观察β-环糊精、包合物、物理混合物，结果见图2。由图可知，β-环糊精在显微镜下呈清晰的柱状、板块状结晶；包合物为不透明团状物，未见明显油状物；物理混合物中结晶与挥发油的细小油滴共存，表明其物相未发生改变，也未形成新物质，只是简单的物理混合。

图2 样品显微镜图（×100）

然后，通过扫描电镜观察β-环糊精、包合物形态学特征，见图3。由图可知，β-环糊精呈柱状、板块状结晶型，表面相对光滑，成像清晰；包合物为不透明团状物，表面相对粗糙，晶粒粒度变小，在晶型上发生了明显变化。

图3 样品扫描电镜图

2.3.3 X 射线衍射法 条件为光源铜靶，波长0.154 18 nm，电压-40 kV，扫描速率-5°／min，扫描范围2θ 4°～60°，对β-环糊精、包合物进行分析，以扫描角度为横坐标，衍射强度为纵坐标，通过Origin 软件绘制X 射线衍射图［18-19］，结果见图4。由图可知，包合物衍射图谱整体峰形和出峰角度与β-环糊精相似，但在2θ 为7°～7.5°、10°～11°、14°～16°、20°～22°、22°～33°、36°～37°、39°～40°、42°～45°、48°～48.5°等多处有新的衍射峰出现或峰形发生裂变，结合图1 表明生成了新晶形，即包合物成功生成。

图4 样品X 射线衍射图

3 讨论与结论

本实验将郁金、当归、茵陈进行粉碎，得到2.5 目颗粒后提取挥发油，预试验发现如果饮片（其中郁金、当归为市售饮片，不经粉碎处理） 直接提取时，在相同水蒸气蒸馏时间下挥发油提取量较低，可能与饮片粒度大、内部挥发油成分难以释放有关；若将郁金、当归直接粉碎成40目以上细粉后再进行提取，虽然提取时间缩短，但在粉碎过程中挥发油有损失，并且在提取时容易出现爆沸、粉末焦糊固结在瓶底等情形，同时产生挥发油粘壁现象，导致挥发油提取量也较低，其原因可能是由于药材粉末过细时，加热后于水中极易形成糊状，粘连沉在水底，易出现焦糊、爆沸，并直接导致挥发油不易被水蒸气带出，故最终确定提取工艺正交实验中将粒度分为≥2.5、≥12、≥20 目。另外，在挥发油提取器中加入一定量石油醚来收集挥发油，等到石油醚完全挥干后再进行精密称定，可解决微量挥发油直接读数不准确的缺陷。

在包合物制备过程中搅拌时间延长时，可在一定范围内提高包合物包合率，同时包合温度升高，反应速度加快，生成包合物量也越大，但温度过高，部分挥发油挥发，包合率反而下降；温度过低，β-环糊精溶解度下降，包合物生成减少。因此，控制一定温度时既能保证β-环糊精溶解度，使挥发油与其充分接触，又可避免高温下搅拌后挥发油逸出，从而提高包合率。

本实验发现，利肝隆颗粒组方挥发油最佳提取工艺为药材粒度≥2.5 目（孔径7.9 mm），加水量12 倍，蒸馏时间8 h；最佳包合工艺为包合温度35 ℃，搅拌时间90 min，挥发油与β-环糊精比例1 ∶6，TLC、显微镜、扫描电镜、X 射线衍射表征显示其已成功形成，而且包合状态良好。同时，该方法操作方便，仪器简单，实用性强，有利于利肝隆颗粒工艺改进，对提高该制剂中挥发油的稳定性有着积极意义。