中麻黄不同生长期3 种药效成分的变化规律

马晓辉， 晋 玲，3∗， 朱田田， 何微微， 黄得栋

［1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000；2.甘肃中医药大学中（藏） 药资源研究所，甘肃 兰州730000；3.甘肃省高校中（藏） 药化学质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州730000］

中麻黄Ephedra intermedia Schrenk ex Mey. 为麻黄科麻黄属植物［1］。始见于《神农本草经》，列为中品，具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的功效［2］。中麻黄含有多种药效成分，主要有麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱等［3］。2015 年版《中国药典》 规定药用麻黄以麻黄碱和伪麻黄碱的总量在0.8%以上为符合药用标准［4］。近年来，由于滥采滥挖致使中麻黄野生资源严重破坏，已被列为濒危药用植物。因此在研究合理保护的同时，科学的采收不仅保证药用来源，同时对其保护也有积极意义［5-6］。虽然目前采用HPLC 法测定制剂和药材中的麻黄碱与伪麻黄碱含有量的方法较多，但运用HPLC 法测定中麻黄不同采收期药效成分动态变化研究尚未报道［7-15］。因而本研究采用HPLC法对甘肃兰州仁寿山及榆中兴隆山所产半野生中麻黄中的麻黄碱、伪麻黄碱以及甲基麻黄碱的变化规律进行研究，以期为确定中麻黄的最佳采收期提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 1525 高效液相色谱仪（二元泵，二极管阵列检测器，美国Waters 公司）；AE-163 分析天平（瑞士梅特勒公司）；BX7200HP 超声波清洗器（上海新苗医疗器械制造有限公司）；LG-500A 高速万能粉碎机 （瑞安市百信药机器厂）；加热鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 试剂 麻黄碱（批号171241-201508）、伪麻黄碱（批号171237-201208）、甲基麻黄碱（批号171247-200301） 对照品均购于中国食品药品检定研究院；三乙胺（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；二正丁胺（分析纯，天津市丰越化学品有限公司）；磷酸（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 样品信息及采样原则

2.1 样品信息 中麻黄药材共22 个样品，采集于甘肃省兰州市仁寿山和榆中县兴隆山，由甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为正品。见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.2 采样原则 在仁寿山及兴隆山各选取2 个野生中麻黄植物居落，每个居落选定较分散的植株设定2 个样方套（10×10），每个样方套按等距法各取5株无病害的中麻黄植株，挂牌并标记，每隔约15 d每株剪取约20 g 草质茎，分装标记，带回分子实验室，并及时干燥处理。样方套设置见图1～2。

3 方法与结果

3.1 色谱条件 Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）； 流动相甲醇-0.092%磷酸溶液 （含有0.04%三乙胺及0.02%二正丁胺）； 体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μm。

图1 样方套Fig.1 Sample set

图2 等距法设置样方套Fig.2 Isometric method set sample square

3.2 色谱系统适用性 在“3.1” 项条件下检测，麻黄碱保留时间11.371 min、伪麻黄碱保留时间13.229 min、甲基麻黄碱保留时间15.827 min。色谱图见图3。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 对照品溶液制备 称取各对照品粉末适量，精密称定，加甲醇使溶解制成混合对照品贮备液，其中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱质量浓度分别为519、447、16 μg／mL。

3.4 供试品溶液制备 取中麻黄干燥草质茎，粉碎，取过6 号筛的细粉0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，称定质量，进行超声处理（功率600 W，频率60 Hz）35 min，静置至室温，再称定质量，用1.44%磷酸溶液补足减失质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜进行过滤，取续滤液，即得。

4 方法学验证

4.1 线性关系考察 取各对照品适量，精密称定，加1.44%磷酸试液制成每1 mL 含麻黄碱519 g、伪麻黄碱447 g、甲基麻黄碱16 g 的溶液，作为对照品贮备液。依次从中精密吸取0.5 mL 置于5 mL 量瓶，用1.44%磷酸试液连续稀释5 次，精密吸取对照品贮备液和稀释液各10 μL，在“3.1” 项条件下测定峰面积，以进样浓度的对数值为横坐标（X），峰面积的对数值为纵坐标（Y），进行回归，结果见表2。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

4.2 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液10 L，在“3.1”项条件下，连续进样6 次，测得麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱峰面积的RSD 分别为3.2%、2.9%、1.4%，表明该仪器精密度良好。

4.3 稳定性试验 取同一批供试品药材粉末0.5 g，精密称定，按“3.4” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，分别于0、2、4、6、8、10 h 进样，测得麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱峰面积的RSD 分别为1.2%、0.4%、0.1% （n=6），表明供试品溶液在10 h 内稳定性良好。

4.4 重复性试验 取同批供试品药材粉末品6 份，每份取约0.5 g，精密称定后，按“3.4” 项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在“3.1”项条件下进样，测得麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱平均含有量分别为0.08%、0.85%、0.004%，RSD 分别为1.03%、0.42%、0.09%，表明该方法重复性良好。

4.5 加样回收率试验 取已知含有量的同一批9份，每份约1.5 g，精密称定，每3 份作为一个浓度水平，分别精密加入中麻黄对照品溶液， 按“3.4” 项下方法制备供试品溶液，在“3.1” 项条件下进样，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

5结果与分析

不同生长期中麻黄草质茎中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱的含有量见表4。可知，在2 个产地的不同生长期，麻黄碱的含有量均明显低于伪麻黄碱，而甲基麻黄碱的含有量则很低。 《中国药典》 规定麻黄药材的质量标准以麻黄碱和伪麻黄碱的总量不低于0.8%。比较同一产地不同生长期中指标成分（麻黄碱和伪麻黄碱） 总含有量，结果显示，2 个产地6 月中旬至7 月底采收的中麻黄中指标成分总含有量均低于《中国药典》 规定的最低含有量，即该时期采收的中麻黄作麻黄使用均不合格。对各生长期中麻黄碱和伪麻黄碱的总含有量变化见图4。可知，各生长期中麻黄中指标成分总含有量变化波动较大，6 月至7 月中旬呈逐渐降低趋势，7 月中旬呈现含有量最低，自7 月中旬之后含有量逐渐增加，10 月中旬达最高。

6 讨论

图4 各样品中指标成分总含有量变化趋势Fig.4 Variation trend of the total contents of index components of various samples

仁寿山及兴隆山各生长期中麻黄中伪麻黄碱含有量近为麻黄碱含有量的10 倍，且二者含有量变化基本呈正相关，可能原因为中麻黄中的生物碱为麻黄碱和伪麻黄碱，二者均具有挥发性，互为立体异构体共同存在，但伪麻黄碱结构比较稳定，因此在干燥药材中伪麻黄碱的含有量一般高于麻黄碱。相比较而言，甲基麻黄碱的含有量甚微，不可用于分析，中麻黄的质量可以麻黄碱和盐酸为麻黄碱为评价指标。

中麻黄仁寿山产地有人工灌溉管道，会定期进行灌溉，而兴隆山产地则完全处于野生状态，无人为因素介入。但2 个产地中麻黄中指标成分的含有量均在6 月上旬、9 月中旬及10 月中旬相对较高，其可能原因为6 月下旬至7 月底为多年生中麻黄营养旺盛生长期，抑制了次生代谢产物的积累，8 月份后营养生长逐渐减慢，次生代谢产物积累开始增加，10 月中旬达到最大积累量，11 月西北地区天气转冷，出现霜降等天气，中麻黄植物逐渐枯死，生物量减少。药材采收期应综合考虑有效成分含有量与产量确定，故中麻黄在10 月到11 月左右采收为佳，此时有效成分含有量最高，生物量还未枯死，产量相对较高。所得结果与《甘肃中草药资源志》 （下册）记载及当地药农认为采收时间为立秋之后基本吻合。

表4 各成分含有量测定结果（%）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%）

影响中麻黄生长及次生代谢产物积累的因素包括遗传及生态环境［16-18］，本研究就不同产地不同生长期中麻黄指标成分含有量进行研究，结果显示6 月中旬至7 月中旬采中麻黄药效成分总含有量呈下降趋势，7 月中旬后逐步升高，至10 月中旬达到最大值，考虑11 月后气候对产量的影响，按《中国药典》 对指标性成分的要求，并结合课题组前期人工更新试验研究栽培中麻黄认为在保障水肥条件下，考虑刈割后生物量恢复等因素，兴隆山及仁寿山产中麻黄可1 年采收2 次，分别为6 月上旬和10 月中旬。