泥附子商品等级划分合理性分析

李 潘， 贺亚男， 罗 杰， 裴 瑾，2， 林俊芝， 杨 明， 张定堃，2∗

（1.成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.四川好医生攀西药业有限责任公司，四川 西昌615000；3.成都中医药大学附属医院，四川 成都610072；4.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌330004）

商品规格等级是中药品质的重要外观标志，也是中药材“辨状论质” “看货评级，分档议价” 的重要指标，在中药材市场流通领域具有不可替代的作用 ［1-3］。为此，1984 年颁布了《七十六种药材商品规格》，为中药质量评价与市场流通起到重要作用。然而，中药材生产方式发生了重大变化，栽培品大量取代野生品成为市场供应主流来源。同时，现代理化分析技术不断发展与普及应用，传统中药材商品规格的科学性也备受质疑［4-7］。因此，有必要对中药材商品规格等级划分的合理性进行再认识与再评价。

附子是毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根，是确有疗效的有毒中药。其毒烈，不少医家避之如蛇蝎，终生不敢使用；其效彰，被誉为“回阳救逆第一品”，治病保命“药中四维”［8-9］。因此，研究影响附子毒效的因素是药材品质优良，用药安全的重要保障。

关于附子的品质，从宋代起就有评价方法的论述。 《彰明附子记》 中记载，泥附子一般以“底平”“体圆” “皮黑” “肉花白” “八角” 或“九角” 者为佳；在质量上， “一个重一两，即是气全，堪用”。近几十年来，关于泥附子感官评价的指标趋于简化，如《七十六种药材商品规格》主要以质量为评价［10-12］。在产地，附子收获后也按照个头大小分档销售、加工炮制。大附子用于加工炮天雄，作为温肾助阳之佳品；中等个头附子用于加工白附片、黑顺片等，作为附子的主流饮片规格；小个头附子直接干燥后充当川乌，作为祛风湿止痛药。因此，深入探讨个头大小对附子毒效的影响规律，对于研究商品规格等级的合理性与科学性，指导附子种植、采收、良种选育、市场流通与临床应用均具有重要意义。

1 材料

1.1 药材 泥附子于2017 年6 月27 日采集于四川省江油市桥楼村GAP 种植基地的同一地块，根据个头大小，将附子分为5 个等级，分别为Ⅰ等0 g＜质量＜20 g、Ⅱ等20 g＜质量＜40 g、Ⅲ等40 g＜质量＜60 g、Ⅳ等60 g ＜质量＜80 g、Ⅴ等质量＞80 g。样品经成都中医药大学药学院裴瑾教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根，外观性状见图1。样品洗净、切片、冷冻干燥，粉碎过2 号筛，备用。阿司匹林肠溶片，由拜耳医药保健有限公司生产，批号J20171021，使用前用0.5%CMC-Na 溶液配成阿司匹林混悬液。

图1 不同等级样品外观性状Fig.1 Appearances of different grades of samples

1.2 试剂 乌头碱、新乌头碱、印乌头碱、次乌头碱、乌头原碱、尼奥林、松果林、塔拉乌头胺对照品均购于成都曼斯特生物有限公司，批号分别为MUST-16062206、 MUST-16032504、 MUST-16101810、MUST-16032106、 MUST-16060306、 MUST-16052503、MUST-17022505、MUST-16031801； 苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、附子宁、去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱对照品购于成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为CHB160912、CHB151203、 CHB160326、 CHB160812、 CHB151111、CHB160922，所有对照品含有量均＞98%。色谱级二甲亚砜和甲酸购于成都市科龙化工试剂厂；超纯水（自制）； 甲醇、 乙腈 （色谱纯， 美国Fisher 公司）；屈臣氏蒸馏水购于广州屈臣氏食品饮料有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 KM 小鼠，SPF 级，体质量18 ～22 g，雌雄各半；SD 大鼠，雄性，体质量180 ～200 g，均由成都达硕实验动物有限公司提供，动物质量合格证号SCXK（川）2015-030，检疫后备用。将动物保持在温度（20±0.5）℃，湿度（55±5）%和12 h光照和12 h 黑暗循环的受控条件下，在实验之前，动物禁食24 h，可自由饮水。

1.4 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪、Agilent 6460C 三重四极杆串联质谱仪 （美国Agilent 公司）；BP211 DAG 电子分析天平（德国Satorius 公司）；CHRIST ALPHAI-4 LSC 冷冻干燥器（上海斯高勒生物科技有限公司）；KQ-500DB型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；SZ-93 A 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 含有量测定

2.1.1 供试品溶液制备 取样品粉末各0.1 g，精密称定，置10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，称定质量，超声提取30 min，取出，放冷，精密称定，补足减失质量，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 分别取各对照品适量，精密称定，用甲醇配制成含14 种生物碱的混合对照品于棕色量瓶中， 质量浓度分别为乌头碱1.905 μg／mL、新乌头碱10.2 μg／mL、次乌头碱2.032 μg／mL、印乌头碱0.464 μg／mL、苯甲酰乌头 原 碱 0.672 μg／mL、 苯 甲 酰 新 乌 头 原 碱1.932 μg／mL、苯甲酰次乌头原碱0.18 μg／mL、乌头原碱0.104 μg／ mL、附子宁4.32 μg／mL、尼奥林2.032 μg／mL、塔拉乌头胺0.33 μg／mL、松果林2.904 μg／mL、去甲乌药碱0.134 μg／mL、去甲猪毛菜碱0.416 μg／mL。储存于4 ℃的冰箱中，备用。

2.1.3 分析条件

2.1.3.1 色谱条件 Phenomenex C18色谱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 ～1 min，2%～20%B；1 ～5 min，20%～50%B；5 ～10 min，50%～75%B；10～15 min，75%～100%B）；体积流量0.45 mL／min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.1.3.2 质谱条件 采用ESI 源，正离子模式检测；脱溶剂温度300 ℃；脱溶剂气流N211 L／min；雾化器压力103.425 kPa；毛细管电压4 000 V；扫描方式为MRM 检测，14 种生物碱成分的多反应监测模式信息见表1，MRM 色谱图见图2。

表1 各成分多反应监测模式信息Tab.1 MRM information of various constituents

2.1.4 方法学考察 参照ICH Q2B 技术指导原则进行。取对照品溶液适量，用甲醇稀释为不同质量浓度梯度的对照品溶液，在拟定的HPLC-MS／MS条件下测定。以待测物质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归。同时测定各待测物的定量限（S／N=10） 和检测限（S／N=3），各成分线性关系、LOD 和LOQ 的结果见表2。精密度、稳定性、重复性与加样回收率前期已研究［13］，表明该方法能满足含有量测定的要求。

表2 各成分线性关系、LOD 和LOQTab.2 Linear relationships，LOD and LOQ of various constituents

图2 各成分MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of various constituents

图3 不同等级附子的含有量测定结果Fig.3 Results of content determination of Aconite with different grades

表3 各成分含有量测定结果（μg／g，n=6）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g，n=6）

2.1.5 样品含有量测定 取5 个不同等级的附子粉末，按“2.1.1” 项下方法制备样品溶液，每个样品平行制备6 份。在“2.1.3” 项条件下进样，计算各供试品溶液中14 种生物碱的含有量，结果见表3。可知，不同等级附子中成分含有量具有显著差别。随着附子质量的增大， 双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、印乌头碱） 与强心成分（去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱） 的含有量分别呈现降低、升高趋势，单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱） 含有量较低，无法比较组间差异， 其余5 种药效成分（尼奥林、塔拉乌头胺、松果林、附子宁、乌头原碱） 具有升高趋势，但组间差异并不明显，见图3。由此推测大个头附子可能具有高效低毒的性能，而小个头附子可能不仅低效，还具有大毒的药性。因此，初步判定附子质量分级具有一定的合理性。2.1.6 聚类分析 采用HemI 分析软件对5 种等级附子的含有量测定结果进行系统聚类分析，结果见图4。根据14 种生物碱含有量的差异，5 种等级的附子可被分为0 ～60 g 和60 ～100 g 两类，其中0～60 g 又被分为0 ～40 g 和40 ～60 g 两类。因此“小个头” 附子与“大个头” 附子中生物碱含有量是有明显差异的，并且同一等级附子组内差异小，证明了分级的科学性。另外，由热图颜色差异可知，新乌头碱、次乌头碱、附子宁、尼奥林、松果林的含有量高于其他生物碱，并且随着附子等级的升高，大毒成分新乌头碱和印乌头碱的含有量显著降低，镇痛成分尼奥林和松果林的含有量明显升高，进一步认为“小个头” 附子具有毒性强、镇痛功效弱的性能。

2.2 不同等级附子镇痛实验［14-15］

2.2.1 样品制备 取5 个不同等级的附子各10 g，提取2 次，第1 次加10 倍量水，浸泡30 min 后，煎煮3 h；第2 次加8 倍量水，煎煮3 h，合并提取液，浓缩至质量浓度0.5 g 生药／mL。取阿司匹林肠溶片适量， 研细， 用0.5% CMC-Na 配制成200 mg／kg 阿司匹林混悬液，作为镇痛阳性药。

图4 各成分在不同等级附子中的平均丰度热图Fig.4 Thermograph of average abundance for various constituents in different grades of Aconite

2.2.2 对小鼠醋酸所致扭体反应的影响 取小鼠56 只，雌雄各半，随机分为7 组，每组8 只。阳性对照组给予200 mg／kg 阿司匹林混悬液，空白组给予蒸馏水10 mL／kg，附子不同等级组均按5 g 生药／kg 灌胃给药，1 次／d，连续3 d。于末次给药后1 h， 给予各组小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸10 mL／kg，立即计时，记录小鼠首次出现扭体反应的时间作为潜伏期，同时记录每只小鼠造模后15 min 内出现的扭体次数，结果见表4。可知，与空白组相比，阳性组与附子组对小鼠醋酸所致扭体反应的影响存在显著差异，并且阳性组疗效优于附子各组。但是，附子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组扭体次数无组间差异，其疗效无显著差别。另外，阳性组相比于空白组显著增大了小鼠扭体潜伏期，附子组无显著性影响，而随着附子等级的升高，存在降低趋势，表明“小个头” 附子可能具有延长小鼠扭体潜伏期的效果。

2.3 不同等级附子最小致死量的测定［16-17］

2.3.1 样品制备 取不同等级附子粉末2 g，精密称定， 用20 mL 70%乙醇超声提取30 min。在5 000 r／min的条件下离心10 min，分离上清液。取1 mL 上清液， 加入19 mL 生理盐水稀释， 经0.22 μm微孔膜过滤，得测试溶液。精密称定乌头碱对照品适量， 溶解在无水乙醇中， 配成200 μg／mL溶液，在测定当天用生理盐水稀释配成10 μg／mL 标准溶液。

表4 不同等级附子对小鼠醋酸所致扭体反应的影响n=8）Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice

表4 不同等级附子对小鼠醋酸所致扭体反应的影响n=8）Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice

注：与空白组比较，∗P＜0.01

阳性组组别 7潜.7伏2±期3.／7m2i∗n扭3.体50次±2数.5／6次∗附子Ⅰ组 5.24±0.98 15.00±3.89∗附子Ⅱ组 4.96±1.02 13.38±3.93∗附子Ⅲ组 4.58±1.00 12.62±6.21∗附子Ⅳ组 4.46±1.27 14.38±5.01∗附子Ⅴ组 4.27±0.73 12.00±4.50∗空白组 3.89±0.60 26.12±3.94

2.3.2 对大鼠最小致死量测定 取大鼠36 只，随机分为6 组，每组6 只。实验时，将每只动物固定，并将标准溶液或测试溶液通过缓慢推注入大鼠尾静脉中，确保药物作用迅速，直到动物死亡。以瞳孔扩张和呼吸停止视为死亡的临界点，记录推注量（V） 和体质量（m），并根据药物浓度（c），由公式1 计算最小致死剂量（MLD），结果见表4。

此实验以MLD 越小，代表毒性越大。见图5，与乌头碱组相比，附子组MLD 显著升高，毒性降低。附子Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组MLD 高于附子Ⅰ、Ⅱ组，即毒性小于Ⅰ、Ⅱ组。另外，附子Ⅲ和Ⅴ组与其他3 组比较具有显著性差异，其MLD 升高，表现出低毒，而附子Ⅲ组MLD 最高，可能与其毒性成分含有量低有关。并且发现随着附子等级的升高，MLD 具有升高趋势，毒性存在降低趋势，但组间差异并不明显。因此，附子等级的差异与毒性在一定程度上具有相关性，进一步证明了分级的合理性。

3 讨论

图5 不同等级附子对大鼠最小致死量的测定结果（n=6）Fig.5 Results of determination of the MLD in rats with different grades of Aconite（n=6）

本研究以化学分析为基础，探讨不同等级附子间的毒效关系，并以药效与毒性实验验证附子分级的合理性。通过化学分析，14 种生物碱在不同等级附子中含有量存在显著差异，而这种差异主要与生物碱在皮部、髓部的分布差异和累积规律有关［10］。附子的长大增重主要是形成层内的髓部比例增大，而形成层外的皮部与韧皮部比例相对降低。再结合新乌头碱、次乌头碱在皮部、髓部的含有量可知，双酯型生物碱主要分布在形成层外的皮部与韧皮部，其含有量约为髓部的2 倍［2］。由此可知，大个头附子中双酯型生物碱含有量较低，主要是由髓部比例高，毒性成分含有量低决定的。并且随着附子等级的升高，呈现出双酯型生物碱降低的趋势。而在测定最小致死量的实验中， “大个头”附子具有较高MLD，呈现出低毒药性，两组实验结果相互验证， 表明 “小个头” 附子毒性强于“大个头” 附子。

附子的镇痛疗效显著，以镇痛效果验证附子分级的药效研究具有代表性［18-20］。在对小鼠醋酸所致的扭体次数的影响研究中，附子水煎液与阿司匹林均具有显著疗效。然而，5 个等级附子的镇痛效果在醋酸扭体实验中并未呈现出显著差异，可能是其生物碱含有量较高，均大于附子镇痛活性的最高有效剂量，因此，不同等级附子间生物碱存在的差异难以通过镇痛活性反映出来。根据化学分析结果，双酯型生物碱在小个头附子中含有量最高，又是镇痛作用的主要成分，因此，随着附子等级的升高，小鼠扭体潜伏期存在缩短的趋势。

综上，根据传统经验，将附子按照个头大小分档，具有一定的合理性。不同等级附子品质差异主要体现在毒性差异，而在镇痛活性上差异并不明显。因此，在充分保障附子减毒效果的前提下，可以考虑将小个头附子加工成炮制品用于临床，这有利于节约资源，提高药材利用率。