气滞胃痛颗粒中挥发性成分提取工艺的优化

郑 鹏， 赵 昭， 李佳佳， 顿佳颖， 李春花∗

（1.河北中医学院药学院，河北 石家庄050200；2.河北省图书馆，河北 石家庄050011）

气滞胃痛颗粒基于《伤寒论》 中的四逆散，由枳壳、香附（炙）、元胡索（炙）、甘草（炙）、白芍、柴胡组成，已在全国数千家医院推广应用20 余年［1］，有效率达85%以上。张春艳等［2］对气滞胃痛颗粒挥发性成分进行表征及药材归属，发现其挥发性成分来源于枳壳与香附，前者主要为柠檬烯，具有减痛、抑菌、消炎、防治癌症的作用［3］；α-香附酮、香附烯酮，具有抗菌消炎、镇痛、抑制子宫收缩等作用，在妇科疾病治疗中有广泛应用［4］。本实验基于响应面法结合信息熵法，优化气滞胃痛颗粒中挥发性成分提取工艺。

1 材料

1.1 仪器 SPH-300 氢气发生器、SPB-3 全自动空气源 （北京HP 分析技术研究所）； 安捷伦7890B 气相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；LQA10002 电子天平（上海乐祺精密电子厂）；BSM1 204 分析天平（上海卓精仪器厂）；KQ-300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料 枳壳（批号16081801）、醋香附（批号16120301） 购自安国药材市场，经河北省药品检验研究院孙宝惠老师鉴定符合2015 年版《中国药典》 一部相关项下规定。 柠檬烯、 α-香附酮（Z1708242）、香附烯酮（Z1705241） 对照品。无水乙醇、甲醇为分析纯（天津市永大化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取［5-6］按组方比例称取枳壳、醋香附各50 g，粉碎后置于圆底烧瓶中，加适量水混匀，连接提取-共沸精馏耦合装置提取一定时间，按2015 年版《中国药典》 规定读取挥发油量，并计算其含有量。

2.2 单因素试验［7］称取样品4 份，其中3 份按2015 年版《中国药典》 规定分别制成粗粉、中粉、细粉，另1 份保持不变，固定浸泡时间3 h、提取时间3 h、加水量7 倍，按“2.1” 项下方法提取挥发油， 测得4 份样品提取率分别为0.25%、0.5%、0.45%、0.3%，即粗粉最高，故选择其作为粒径。

然后，对提取时间、加水量、浸泡时间进行考察。称取5 份样品，固定浸泡时间3 h、加水量7倍，提取2、4、6、8、10 h，测得挥发油提取率分别为0.45%、0.6%、0.7%、0.7%、0.7%，即提取6 h 时最高，故选择5、6、7 h；固定浸泡时间3 h、提取时间3 h，加入7、9、11、13、15 倍量水， 测得挥发油提取率分别为0.5%、 0.6%、0.65%、0.8%、0.8%，即加水量13 倍时最高，故选择12、13、14 倍；固定加水量7 倍、提取时间3 h，浸泡0、1、2、3、4 h，测得挥发油提取率分别为0.25%、0.35%、0.35%、0.35%、0.3%，即浸泡1 h 时最高，故选择0.5、1、1.5 h。

2.3 GC 法测定柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮含有量

2.3.1 色谱条件［8-9］安捷伦HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；氢火焰离子化检测器（FID） 检测；程序升温，见表1；进样量5 μL；分流比70 ∶1；载气N2；进样口温度250 ℃；检测器温度260 ℃；空气体积流量390 mL／min；氢气体积流量36 mL／min；尾吹气体积流量15 mL／min；氮气体积流量1 mL／min。色谱图见图1。

表1 升温程序Tab.1 Heating-up programs

2.3.2 对照品溶液制备 分别精密称取柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮对照品7.90、6.70、1.92 mg，置于5 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 即得（1.58、1.34、0.384 mg／mL）。

2.3.3 供试品溶液制备 按“2.1” 项下方法提取挥发油，无水硫酸钠干燥后3 000 r／min 离心6 min，取0.1 mL 置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解，即得。

图1 各成分GC 色谱图Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.3.4 线性关系考察 取对照品溶 液， 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定5 次，其中α-香附酮、 香附烯酮进样量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL， 柠 檬 烯 分 别 为1.0、 2.0、 3.0、4.0、5.0 μL。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度试验 取对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮峰面积RSD 分别为0.94%、0.52%、1.73%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下于2、4、6、8、10 h 进样测定，测得柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮峰面积RSD 分别为0.27%、0.16%、0.25%，表明溶液在10 h 内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 按“2.3.3” 项下方法制备6份供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮峰面积RSD分别为0.26%、0.12%、0.23%，表明赶快方法重复性较好。

2.3.8 加样回收率试验［10-11］分别称取一定量柠檬烯含有量已知的枳壳饮片及α-香附酮、香附烯酮含有量已知的醋香附饮片，按2015 年版《中国药典》 规定制成粗粉， 精密称取6 份， 每份0.25 g，加入适量对照品溶液，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮平均加样回收率分别为97.15%、97.83%、98.96%，RSD 分别为1.35%、1.61%、0.43%。

2.4 工艺优化

2.4.1 响应面法 在单因素试验基础上，采用Design Expert 10.0 软件，选择加水量（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C） 作为影响因素，挥发油提取率及柠檬烯、香附酮、香附烯含有量的综合评分（Y） 作为评价指标，设计3 因素3 水平、15个试验点的响应面分析试验（12 个析因试验、3个中心试验）。因素水平见表3，结果见表4。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 试验设计及结果Tab.4 Design and results of tests

2.4.2 信息熵［12-13］1 个评价指标系统中有m 个评价对象、n 个评价指标，其形成的原始指标数据矩阵为Y= （yij） mn。对表5 数据处理，建立原始评价指标矩阵（Xij）mn 和概率矩阵（Pij）mn。

计算各项指标信息熵，得到评价指标Hi，公式为Hi=-1／lnη×∑n

j=1Pij×lnPij，得Hi=［0.999 2 0.994 3 0.994 9 0.994 3］。再计算各指标权重系数Wi， 公 式 为［0.041 1 0.331 2 0.298 5 0.329 2］，分别代表挥发油提取率及柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮含有量。

2.4.3 方程拟合与分析［14］通过Design Expert 10.0 软件对表4 数据进行多元回归拟合分析，得方程为Y=0.91+0.029A+0.049B+0.037C-0.036AB+0.061AC+0.035BC-0.061A2-0.088B2-0.070C2，方差分析见表5。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表可知，模型有显著影响（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05） 不显著，表明模型真实可靠；各因素影响程度依次为B＞C＞A；各一次项、各二次项、 交互项AC 有显著影响 （P ＜0.05， P ＜=0.882 0，表明该模型可解释88.20%响应值的变化；r=0.916 7，表明响应值的变化有91.67%来源于所选变量，响应面图［15-16］见图2。通过Design Expert 10.0 软件分析，得到最优工艺为加水量13.418 倍， 浸泡时间1.149 h，提取时间6.518 h，考虑到实际操作情况，将其修正为加水量13 倍，浸泡时间1.1 h，提取时间6.5 h。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.4.4 验证试验 采用“2.4.3” 项下优化工艺进行3 批验证试验，测得综合评分分别为0.931 6、0.912 0、0.923 0，平均0.922 2，与模型预测值0.932 2 相当（偏离率为1%），表明模型预测性良好，稳定可靠。

3 讨论

正交试验只能进行线性数学模型拟合［17］，确定单一因素对试验结果的影响，但往往与真实值有较大差异；响应面法通过Design Expert 10.0 软件，可更直观地分析各交互因素对试验结果的影响，结果与真实值差异较小。

目前，关于挥发油最佳提取工艺的研究大多仅选择其提取率作为评价指标，但所含有效成分含有量也是其发挥药效的重要因素。本实验先对挥发油提取率进行单因素试验，再综合柠檬烯、α-香附酮、香附烯酮含有量进行响应面优化，以期提高其准确性。由于柠檬烯含有量与香附烯酮、α-香附酮有明显差异，易于提取前者的方法不一定适合后两者，故再通过信息熵赋予各指标权重系数，计算其综合评分，可使优化工艺更严谨，并能有效提高气滞胃痛颗粒中挥发油含有量，为该制剂进一步开发提供科学依据。