车桑子大孢子发生与雌配子体发育

卢雪佳 刘方炎 高成杰 李 昆

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，昆明 650224)

车桑子(Dodonaeaviscosa(Linn.) Jacq.)隶属于无患子科(Sapindaceae)车桑子属(Dodonaea)，灌木或小乔木。它具有耐干旱、萌生能力强、根系发达和丛生性等生长习性，是一种良好的保水固土植物，常被用作造林困难地区的先锋树种，具有较高的生态价值[1]。在我国金沙江干热河谷地区，车桑子亦是稀树灌丛、灌丛及灌草丛等乡土植被类型的重要组成成分[2]。

野外调查发现，车桑子开花量大，但结籽率低，种子败育率较高，自然更新能力较差。研究表明植物自身的生殖过程、种子的萌发、幼苗的生长等自身因素以及外界环境因素及人为干扰因素等均能限制植物自然更新[3]。目前，对车桑子的研究主要集中在其干旱胁迫下种子及幼苗的生长状况[4]、光合特性及光合水分生理特性[5]、各项生态因子对种子的萌发特性及影响幼苗生长发育的影响[6～7]、叶片旱生结构特征[8]、药用价值[9]等方面研究。尚未发现有关车桑子繁殖特征及繁殖生物学方面的研究报道。本文采用常规石蜡切片法对车桑子的大孢子发生及雌配子体的发育过程进行观察和研究，试图从生殖生物学方面探究影响车桑子结籽率和种子败育的原因。同时，文中分析了车桑子花朵的外部形态特征与其内部发育状况的联系，为通过外部形态判断大孢子发育时期提供一定依据。本试验拟为车桑子的生殖生物学和发育生物学研究提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

于2017和2018年车桑子开花时期，在云南省楚雄自治州元谋县干热河谷区稀树灌草丛植被中，选取不同发育阶段的车桑子雌花花蕾和花朵，保存于FAA固定液(50%酒精90 mL∶甲醛5 mL∶冰醋酸5 mL)中，带回实验室后，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

大孢子发生与雌配子体发育过程的观察采用常规石蜡切片法。即从固定液中取不同发育时期的花蕾及花朵，剥离花萼后经系列脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。用切片机进行连续切片，切片厚度为8～10 μm，番红—固绿进行对染，中性树脂封片，蔡司光学显微镜下观察并拍照。车桑子不同时期花蕾结构的外部特征采用体式显微镜观察并拍照。

2 观察结果

2.1 车桑子大孢子的发生

车桑子子房是三个心皮合生构成三心室、中轴胎座的结构，每个心室具有上、下两个胚珠(图1：A)。花柱中空形成花柱道(图1：B)。胚珠具有两层珠被，且为横生胚珠，无承珠盘(图1：C)。

在心皮的内侧沿心皮的合缝上，最初产生一团向心室内腔突起的细胞即胚珠原基。随着进一步发育，胚珠原基的前端部分细胞发育成珠心，胚珠原基的基部部分细胞发育成珠柄。在珠心端，珠心表皮细胞下出现一个细胞质浓厚、细胞核明显，体积较大的细胞即孢原细胞(图1：D)，此时珠被并未分化。随后，孢原细胞经过平周分裂和垂周分裂后，形成一个周缘细胞及一个造孢细胞(图1：E)。造孢细胞经过进一步的发育，形成大孢子母细胞(图1：F)，早期的内外两层珠被均出现。大孢子母细胞经过第一次减数分裂形成一个二分体(图1：G)，经过第二次减数分裂形成四个成直线形排列的大孢子细胞，即四分体(图1：H)，此时内珠被高度还未超过珠心，而外珠被高度已超过珠心。随着发育的进行，靠近珠孔端的三个大孢子细胞开始逐渐退化，靠近合点端的一个大孢子进一步发育，形成功能大孢子(图1：I)。功能大孢子进一步发育，逐渐占据部分珠心细胞形成具有大液泡的单核胚囊(图1：J)，其余三个大孢子已退化消失。此时内外珠被均已形成，且珠心完全包裹在两层珠被内。胚囊的发育类型属于单孢子蓼型，珠心组织是由多层细胞组成的厚珠心类型。

2.2 车桑子雌配子体的发育

随着单核胚囊的继续发育，单核胚囊的细胞核逐渐移向胚囊中心。随后进行一次有丝分裂，形成两个新核(图1：K)，并且这两个新核逐渐向相反方向移动(图1：L)。接着这两个新核相继进行第二次有丝分裂，形成四个核，即四核胚囊(图1：M)。这四个游离核进行第三次有丝分裂，形成八个游离核即八核胚囊(图1：N)。之后，每端各有一个游离核移向胚囊中央部位，这两个游离核组成极核(图1：O)，并随着细胞化组成一个形状较大的中央细胞(图1：Q)。靠近珠孔端的三个游离核逐渐细胞化，其中一个较大的细胞被称为卵细胞，其余两个较小的被称为助细胞，共同组成卵器(图1：P)。远离珠孔端的三个游离核，继续细胞化形成三个细胞，即反足细胞(图1：O)。

图1 车桑子大孢子和雌配子体发育过程 A.子房横切；B.花柱横切；C.横生胚珠；D.孢原细胞；E.周缘细胞和造孢细胞；F.大孢子母细胞；G.二分体；H.四分体；I.功能大孢子；J.单核胚囊；K.二核胚囊；L.两个游离核反向移动；M.四核胚囊；N.成熟胚囊；O.反足细胞和极核；P.卵器；Q.中央细胞；R～T.异常胚囊 Ac.孢原细胞；Sc.造孢细胞；Pc.周缘细胞；Mmc.大孢子母细胞；Fm.功能大孢子；Pn.极核；At.反足细胞；Sy.助细胞；Ec.卵细胞Fig.1 Megasporogensis and female gametophyte of D.viscosa A.Cross-section of ovary; B.Cross-section of stylus; C.Amphitropous ovule; D.Archesporial cell; E.Sporogenous cell and parietal cell; F.Megaspore mother cell; G.Diad; H.Tetrad; I.Functional megaspore; J.Uninucleate embryo sac; K.Two-nucleate embryo sac; L.Reverse movement of two free nuclei; M.Four-nucleate embryo sac; N.Mature embryo sac; O.At Antipodal cell and polar nuclei; P.Egg apparatus; Q.Central cell; R-T.Abnormal embryo sac Ac.Archesporial cell; Sc.Sporogenous cell; Pc.Parietal cell; Mmc.Megaspore mother cell; Fm.Functional megaspore; Pn.Polar nuclei; At.Antipodal cell; Sy.Synergid cell; Ec.Egg cell

此外，车桑子雌配子体发育过程中出现少数异常现象。(1)成熟胚囊中细胞不明显，并且胚囊中并非中空，胚囊中有一层组织细胞连接珠孔端和合点端(图1：R、S)。(2)成熟胚囊中细胞核并未进一步细胞化，而是仍以八个游离核的状态存在(图1：T)。

2.3 雌花发育特征与其内部结构之间的联系

通过对雌花的花芽开始膨大到雌花的萎蔫的一系列形态发育过程的观察(表1，图2)，结合雌花内部结构的发育过程，综合分析可发现，雌花的外部发育情况可以大致反映内部结构的发育情况。当雌花处于小花蕾(图2：A)时，车桑子内部结构中心皮原基开始出现。随着雌花的发育，花蕾开始萌动伸长(图2：B～C)，此时内部结构属于孢原细胞出现并开始分裂形成造孢细胞的过程。当花蕾进一步伸长并膨大，柱头形成并且伸长(图2：D)，此时内部发育为从造孢细胞发育为大孢子母细胞，并开始进行减数分裂，少数处于二分体时期。当雌花的柱头微微露出萼片，子房膨大(图2：E)，此时大孢子母细胞进行减数分裂，呈现二分体、四分体状态。随着柱头的进一步伸长，伸出萼片一段长度(图2：F)，雌蕊进入单核胚囊阶段。萼片尖处变红且开始展开，处于开花前期(图2：G)，雌蕊的单核胚囊进行两次有丝分裂，形成二核、四核胚囊。开花初期，部分萼片展开，子房膨大(图2：H)，此时进行第三次有丝分裂，开始出现八核胚囊。盛花期，萼片全部展开，子房外露且膨大明显(图2：I)，雌花处于成熟胚囊期。

图2 车桑子雌花的发育过程Fig.2 The female flower development of D.viscosa

阶段Stage外部形态特征External morphological characteristics内部结构发育过程Internal structure development processA小花蕾期The period of small flower buds心皮原基出现Carpel primordia appearB-C花蕾开始萌动、伸长Flower buds begin to sprout and elongate孢原细胞分裂形成造孢细胞Archesporial cells split to form sporogenous cellsD花蕾进一步膨大、伸长,柱头形成Flower buds swell and elongate,Stigma formation大孢子母细胞到二分体时期The period from megaspore mother cell to diadE露白期,柱头开始稍微露出萼片外White appearing, the stigmas begin to reveal slightly outside the sepals二分体到四分体时期The period from diad to tetradF柱头逐渐伸长,露出萼片外一定长度The stigmas gradually elongate, revealing a certain length outside the sepals单核胚囊期The period of uninucleate embryo sacG柱头进一步伸长,萼片包裹开始松展The stigmas extend further and the sepals begin to loosen二核胚囊到四核胚囊期The period from two-nucleate embryo sac to four- nucleate embryo sac H开花初期,萼片部分展开In the early period of flowering, the sepals spread out partially出现八核胚囊Eight- nucleate embryo sac appearsI盛开期,萼片全部展开In full blooming, the sepals are all spread out成熟的八核胚囊Mature eight- nucleate embryo sac

3 讨论

车桑子子房为3心皮构成的3心室，中轴胎座，胚珠横生，具有两层珠被，厚珠心，且每个心室有上下两个胚珠，无承珠盘。大孢子母细胞减数分裂形成直线型排列的四分体，靠近合点端的大孢子分化为功能大孢子，其余三个大孢子逐渐退化消失。胚囊发育类型为单孢子蓼型。成熟胚囊是8核7细胞类型。这些胚胎学特征与同车桑子亚科的文冠果(Xanthocerassorbifolium)、掌叶木(Handeliodendronbodinieri)及茶条木(Delavayatoxocarpa)的特征基本相同，但文冠果每个心室有5～8个胚珠排成两列，发育前期为弯生胚珠，后变为倒生胚珠，掌叶木是弯生胚珠，茶条木子房2心室，文冠果(X.sorbifolium)、掌叶木(H.bodinieri)和茶条木(D.toxocarpa)的这些胚胎学特征区别与车桑子[10～12]。作为车桑子属的模式植物，本试验揭示了车桑子的大孢子发生与雌配子体的发育过程，其双珠被、厚珠心及单孢子蓼型发育等胚胎学特征较为原始[13]。这些为车桑子属植物的胚胎学发育特征提供了一定依据，同时丰富了车桑子亚科植物胚胎学发育特征的基础资料。

植物的生殖成功需要经历一系列复杂过程，贯穿植物的整个生活史周期，出现任何问题将会影响生殖的成功与否[14～15]。一般来说，植物的开花、坐果、种子萌发及幼苗生长等是研究种子植物生殖生物学的基础[15]。自然状况下，有性生殖的成功与否直接影响了植物生长的数量多少和种群的扩大[16]。据研究表明，干热河谷地区车桑子存在种群自然更新困难的问题[3]。种子的败育可能是导致天然更新不良的原因之一。根据笔者调查，金沙江干热河谷区车桑子的结籽率较低，仅为(22.5±2.5)%，其自然结籽率低的原因有待探明。胚胎学特征和环境条件等能引起种子的败育，植物大孢子发生和雌配子体发育过程中出现的异常现象是引起种子败育的主要胚胎学原因之一[17]。主要集中在以下几个方面：(1)大孢子发生异常。软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)雄株胚珠原基不发育，进而导致大孢子不育[18]；香木莲有约27.9%的功能大孢子退化[19]。马蹄参(Diplopanaxstachyanthus)的功能大孢子发生败育，进而引起其余三个大孢子随机一个发育为功能大孢子[20]。(2)卵细胞发生异常。红花木莲(Manglietiainsignis)的成熟胚囊中约有79.1%卵细胞败育[21]。香木莲(Manglietiaaromatica)约有80%的 卵器在受精前提前退化[19]。(3)胚囊发育异常。马蹄参(D.stachyanthus)二核胚囊期出现二核的大小不均现象，且马蹄参(D.stachyanthus)成熟的胚囊中约有98.8%的胚囊腔中仅有一个较明显的细胞[20]。喜树(Camptothecaacuminata)出现很多没有胚囊核的空腔[22]。翅果油树(Elaeagnusmollis)的成熟胚囊出现部分胚囊小的异常现象[23]。本研究发现，车桑子成熟胚囊出现少数异常现象，一方面成熟胚囊中并非中空的且细胞不明显，胚囊中有一层组织细胞连接珠孔端和合点端。另一方面成熟胚囊中游离核并未进一步细胞化，而是仍以八个游离核的状态存在。车桑子的异常现象将可能导致生殖细胞的无法形成，进而无法正常受精。据此推测，车桑子雌花发育过程中的胚囊异常发育现象和游离核的不正常发育可能是导致其自然结籽率低的原因之一。此外，导致植物自然结籽率低的原因很多，如性别器官的形成是否正常、小孢子发生和雄配子发育是否正常、生殖细胞的发育是否正常、传粉受精的过程是否有障碍以及胚珠发育成种子的过程是否出现异常等。因此，车桑子自然结籽率低的问题还可以从生殖过程的各个环节探寻其原因，且对于雌配子体发育异常的现象产生原因还需进一步研究。