毛酸浆(Physalis pubescens)花形态特征与小孢子发育

冯学超 陈露露 杜可玉 李勇鹏 赵凌侠*

(1.上海交通大学农业与生物学院植物生物技术研究中心，上海 200240； 2.上海交通大学农业与生物学院番茄联合研究中心，上海 200240)

雄蕊是开花(flowering plant)/被子(Angiosperms)植物花雄性生殖器官，与植物繁殖、物种延续、果实发育及产量形成密切相关；其雄性配子体发育经历了造孢细胞、花粉母细胞、小孢子发育成成熟花粉生物学过程[1]。尽管模式植物拟南芥(Arabidopsisthalina)、水稻(Oryzasativa)、烟草(Nicotianatabacum)和番茄(Solanumlycopersicum)小孢子发育已进行广泛的研究[2～8]，而物种间遗传背景和进化方式的差异必将表现出小孢子发育的多样性。茄科毛酸浆(Physalispubescens)与模式植物亲缘关系较远，其小孢子发育与番茄差异将为深入研究茄科植物花发育提供重要参考；特别是花萼膨大成“灯笼形”包被果实这一独特的生物学特性可以免遭环境污染或损伤。毛酸浆作为半野生水果风味独特，富含多糖、氨基酸、矿物质、维生素类、类胡萝卜素、生物碱和酸浆苦素；还具有抗氧化、降压、利尿、抗菌、镇痛、消炎、强心、催产、降血脂和抗癌等临床功效[9～14]。《本草纲目》记载：“酸浆利湿除热。利湿故能化痰治疽，除热故清肺治咳”。

基于此，本研究采用比较生物学方法解析毛酸浆(P.pubescens)与番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)花形态特征和小孢子发育，以期为深入研究毛酸浆及揭示茄科植物花发育提供一些信息。

1 材料方法

1.1 植物材料

毛酸浆(Physalispubescens)系黑龙江省(121°11′～135°05′E，43°26′～53°33′N)地方品种，种子是购自哈尔滨市鲜果剖取阴干后所得；樱桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiformeNo.22)种子保存于上海交通大学番茄联合研究中心。温汤(45℃)浸种60 min，室温浸种8 h，26℃育苗箱催芽。待种子露白(胚芽初现)播种于装有湿润育苗土60孔育苗穴盘(1粒/穴)；4片真叶展开时小苗定植于上海交通大学浦江绿谷基地日光温室，正常水肥管理。

1.2 取样和组织切片制备

从-11～0 dpa(开花当日days post anthesis)每天上午8～10时取毛酸浆花蕾/花朵，以樱桃番茄为参照。用电子游标卡尺(CD-15CPX,Mitutoyo,Japan)测量花器大小，用相机(Canon，EOS 800D，Japan)拍照。为了观察小孢子发育，将不同发育期花蕾在FAA液(37%甲醛∶冰醋酸∶无水乙醇∶双蒸水=v∶v∶v∶v=5∶5∶63∶27)中固定，抽真空更换新FAA液4℃保存。梯度乙醇脱水(70%、80%、95%)30 min，无水乙醇脱水2 h；曙红(上海源叶生物有限公司，上海)乙醇饱和溶液着色。样品预渗透(无水乙醇：Basne Luqizd Technoovt 7100=v∶v=1∶1)2 h；25℃条件渗透(1 g硬化剂Ⅰ溶于100 mL Basne Luqizd Technoovt 7100中,Kulzer and Co.,Wehrheim,Germany)过夜。在灌注包埋液(硬化剂Ⅱ∶渗透液=v∶v=1∶14)包埋板上包埋样品；48℃加热10 min，60℃烘箱中硬化48 h。用半薄切片机(Leica RM2265，Germany)切成厚3 μm切片。蒸馏水展片，酒精灯烘干残余水粘片于载玻片。用1%甲苯胺蓝水溶液(甲苯胺蓝∶硼酸∶双蒸水=w∶w∶v=1∶1∶100，Toluidine Blue O，TBO)染色40 s，双蒸水洗去残余染液；烘干后滴加中性树胶加盖玻片通风橱中过夜风干；中性树胶封片，在显微镜(Nikon Eclipse 80i,USA)下观察小孢子发育并拍照。

2 结果分析

2.1 花形态特征

毛酸浆(P.pubescens)为单花腋生，比樱桃番茄花小，番茄系复总状花序，假二叉分枝(图1:a，e)。毛酸浆花萼基部相连，中裂成“钟”状(图1:c，i)；樱桃番茄花萼深裂至基部，均为绿色花萼(图1:d，k)。毛酸浆5枚淡黄色花瓣交叠呈“五角星”花冠，花瓣有紫色“眼状”斑纹，并与花药齐平(图1:b，i)。樱桃番茄“披针”花瓣深裂基部相连，黄色(图1:e～f，k)。毛酸浆淡紫花药借助花丝着生于花瓣基部，顶颈可育，背部开裂散粉(图1:b，i)。樱桃番茄黄色花药顶颈不育，通过花丝着生花基部、侧连成花药锥，腹缝开裂散粉(图1:g，k)。毛酸浆和樱桃番茄花柱浅绿色(图1:c，h)，前者短于后者(表1)。

图1 毛酸浆(P.pubescens)与樱桃番茄(S.lycopersicum var.cerasiforme No.22.)花器形态与发育 A.毛酸浆花；B.毛酸浆花瓣和雄蕊；C.毛酸浆雌蕊和花萼；D.樱桃番茄花萼；E.樱桃番茄花；F.樱桃番茄花瓣；G.樱桃番茄雄蕊；H.樱桃番茄雌蕊；I.毛酸浆花发育(-11～0 dpa)；J.毛酸浆果实(7 dpa)；K.樱桃番茄花发育(-11～0 dpa)；L.樱桃番茄果实(7 dpa)Fig.1 Morphologicalcharacteristics and development of the flower in P.pubescens and S.lycopersicum var.cerasiforme No.22 A.Flowerof P.pubescens; B.Petals and stamens of P.pubescens; C.Sepals and pistils of P.pubescens; D.Sepal of S.lycopersicum var.cerasiforme; E.Flower of S.lycopersicum var.cerasiforme; F.Petal of S.lycopersicum var.cerasiforme; G.Stamen of S.lycopersicum var.cerasiforme; H.Pistil of S.lycopersicum var.cerasiforme; I.Development of buds of P.pubescens(-11-0 dpa); J.Fruitof P.pubescens(7 dpa); K.Development of buds of S.lycopersicum var.cerasiforme(-11-0 dpa); L.Fruitof S.lycopersicum var.cerasiforme(7 dpa)

种Species花萼长Sepal length花萼宽Sepal width花药长Anther length花丝长Filament length花柱长Style length毛酸浆P.pubescens5.20±0.502.10±0.102.13±0.183.05±0.514.09±0.15樱桃番茄S.lycopersicum var.cerasiforme8.60±1.301.40±0.105.94±0.220.94±0.195.50±0.22

表2 小孢子发育关键特征期

毛酸浆花瓣紫色斑纹、紫花药背裂散粉与茄属(Solanum)番茄族(Lycopersicumsection)乳白花药、顶颈可育和顶端散粉的类番茄茄(S.lycopersicoides)，黄花药、顶颈可育、腹缝开裂散粉的潘那利番茄(S.pennellii)及花药黄色、顶颈不育、腹缝开裂散粉的秘鲁番茄(S.peruvianum)和栽培番茄(S.lycopersicum)的花器特征明显不同。

2.2 小孢子发育

第一阶段，U形造孢期(-11 dpa)。毛酸浆花蕾长1 mm，萼片紧闭(图1:i)。花药表皮层、药室内壁、中层和横切绒毡层清晰可见；横切“蝶形”花药由药隔和连结组织分成4个药室，原表皮下的基本分生组织分化形成单层“U”形孢原细胞(archesporial cell)(图2:a)。而樱桃番茄花蕾1.25 mm；花粉囊的药室和造孢细胞初显(图3:a)。

第二阶段，造孢细胞平周分裂期(-10 dpa)。花蕾(淡黄色)长1.5 mm，紧闭(图1:i)。单层造孢细胞经过平周分裂成双层(图2:b)。樱桃番茄花蕾长1.5 mm、紧闭(图1:k)；药室内壁细胞平周分裂成多层；花粉囊腔室造孢细胞平周分裂至2～3层，细胞体积变大形成清晰内凹“C”形造孢细胞群(图3:b)。

第三阶段，小孢子母细胞形成期(-9 dpa)。毛酸浆花蕾长2.31 mm、紧闭(图1:i)。造孢细胞经平周和垂周分裂、体积增大，形成有棱角小孢子母细胞；药室内壁细胞平周分裂成双层(图2:c)。同期的樱桃番茄绿色花蕾长3.88 mm、微张(图1:k)；造孢细胞进入“四分体”时期，经多次平周分裂药室内壁细胞分化成多层；中层细胞和绒毡层也清晰可见(图3:c)。

第四阶段，四分体时期(-8 dpa)。花蕾长度与-9 dpa(2.31 mm)相近，而径向生长明显，花蕾(黄色)仍处于闭合状态。小孢子母细胞进入“四分体”时期，并开始与绒毡层产生离层(图2:d)。而樱桃番茄绿色花蕾开口逐渐变大，长4.25 mm(图1:k)；“四分体”发育成单独的小孢子，绒毡层变薄或并开始解体，药室腔增大(图3:d)。

第五阶段，单核小孢子早期(-7～-6 dpa)。黄色花蕾长至2.46 mm，仍处于闭合状态(图1:i)。“四分体”发育成不规则/带棱角小孢子，不过小孢子外壁因造孢素沉积和内容物较少仍仅被甲苯胺蓝染成浅蓝；中层细胞为小孢子发育提供营养而被吸收并逐渐消失，药室药隔组织仅存2～3层内壁细胞(图2:e～f)。樱桃番茄绿色花蕾长5.38 mm、微开花瓣初显(图1:k)；而花粉囊药隔组织发育迅速，沿药室药隔组织内凸明显不同于毛酸浆(图3:e～f)。

第六阶段，单核小孢子中期(-5 dpa)。闭合的淡黄花蕾长4.15 mm(图1:i)。小孢子体积逐渐变大，形状不规则；绒毡层解体仅存少许残片(图2:g)。而此时的樱桃番茄，花蕾长6.38 mm，花瓣从萼片伸出约0.5 mm(图1:k)。小孢子变圆，绒毡层严重解体仅存残片；药隔组织向药室内凸更加明显(图3:g)。

第七阶段，小孢子发育晚期(-4 dpa)。萼片变绿，“钟形”花蕾长4.77 mm，微张，隐约可见淡黄花瓣(图1:i)。小孢子体积逐渐变大，颜加深(图2:h)。樱桃番茄“柱形”绿色花蕾长7.13 mm，顶端微张，白色花瓣从萼片伸出1.63 mm(图1:k)；小孢子变圆并被甲苯胺蓝染成深色；药隔组织继续向药室内突(图3:h)。

第八阶段，花粉形成初期(-3 dpa)。花蕾纵向生长缓慢，径向生长迅速，萼片打开，黄色花瓣清晰可见(图1:i)。球形小孢子因孢粉素沉积和内容物增加而被染成深蓝色；中空的隔膜组织接近崩溃(图2:i)。而樱桃番茄花蕾长8 mm，花瓣从萼片伸出2 mm(图1:k)；小孢子发育成近圆形多面体，隔膜组织也开始降解；药隔组织继续向药室内凸(图3:i)。

第九阶段，花粉成熟早期(-2 dpa)。花蕾长6.62 mm，花萼停止生长，黄色花瓣从花萼伸出2.0 mm(图1:i)。球形花粉成熟，隔膜组织消失，药室变二为一(图2:j)。樱桃番茄花蕾长6.9 mm，花瓣伸出5.3 mm，此时花蕾仍保持闭合(图1:k)。球形花粉大小不一，接近成熟，隔膜降解也使药室变二为一；药隔组织仍快速向药室内凸(图3:j)。

第十阶段，花粉成熟期(-1 dpa)。大花蕾长7.23 mm，花瓣伸出花萼3.1 mm并叠抱，花蕾仍处于闭合状态(图1:i)。花粉成熟，花药裂口区域仅存1层细胞(图2:k)。樱桃番茄花蕾长8.0 mm，黄色花瓣微张伸出花萼6.1 mm(图1:k)。花粉成熟，裂口区仅存1层细胞，药隔组织继续向药室内凸(图3:k)。

第十一阶段，散粉期(0 dpa)。淡黄瓣展开(图1:a～d)。药囊背缝开裂，花粉散出(图2:l)。樱桃番茄黄色花瓣展开，祼露出黄色花药，进入开花期(图1:k)。花药腹缝开裂，成熟花粉散出，药隔组织继续发育并伸至药室中部，约占药室空间的1/2(图3:l)。

图2 毛酸浆小孢子发育(-11～0 dpa) a～l.毛酸浆小孢子在-11～0 dpa期的发育 C.药隔组织；E.表皮层；En.药室内壁；ML.中层；MMC.小孢子母细胞；MSp.小孢子细胞；PG.花粉粒；Sm.隔膜组织；Sp.造孢细胞；StR.裂口区域；T.绒毡层；Tds.四分体；V.维管束组织；Va.液泡Fig.2 The microspore development in P.pubescens during -11-0 dpa a-l. Indicatemicrospore developmentstages during -11-0 dpa C. Connective tissue; E. Epidermis; En. Endothecium; ML. Middle layer; MMC. Microspore mother cells; MSp. Microspores; PG. Pollen grains; Sm. Septum; Sp. Sporogenous cells; St. Stomium; StR. Stomium region; T. Tapetum; Tds. Tetrads; V. Vascular bundle; Va. Vacuoles

图3 樱桃番茄小孢子发育(-11～0 dpa) a～l.小孢子不同发育期(-11～0 dpa) C.药隔组织；E.表皮层；En.药室内壁；ML.中层；MMC.小孢子母细胞；MSp.小孢子细胞；PG.花粉粒；Sm.隔膜组织；Sp.造孢细胞；StR.裂口区域；T.绒毡层；Tds.四分体；V.维管束组织；Va.液泡Fig.3 The microspore development in S.lycopersicum var.cerasiforme No.22 during -11-0 dpa a-l. Indicatemicrospore development stages during -11-0 dpa C. Connective tissue; E. Epidermis; En. Endothecium; ML. Middle layer; MMC. Microspore mother cells; MSp. Microspores; PG. Pollen grains; Sm. Septum; Sp. Sporogenous cells; St. Stomium; StR. Stomium region; T. Tapetum; Tds. Tetrads; V. Vascular bundle; Va. Vacuoles

3 讨论

毛酸浆(P.pubescens)和樱桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)均为茄科黄色浆果类植物，二者花器形态存在明显差异。开花(0 dpa)前，毛酸浆花萼生长缓慢，开花后未开裂基部生长迅速并形成“灯笼罩”包被果实(图1:i～j)。樱桃番茄5枚花萼基部不聚合，在开花前、后生长速度没有明显改变，无花萼包被果实的现象(图1:k～l)。毛酸浆淡黄花瓣紫色斑纹、淡紫花药在花瓣基部着生、顶颈可育、不侧连和背部开裂散粉方式与樱桃番茄明显不同，后者黄色花瓣和花药、花药“顶颈不育”、侧连成花药锥、腹缝开裂散粉(图1:k～l)。尽管二者均起源于南美大陆，这些花器形态差异可能与其适应南美的复杂生态环境、传粉昆虫对花色偏爱的协同进化有关[15]。

毛酸浆(P.pubescens)和樱桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)小孢子发育进程也不尽相同。至“四分体”时期，毛酸浆发育比樱桃番茄迟(图2:a～d，图3:a～d)；而从“四分体”后至花粉成熟却表现出毛酸浆小孢子发育快于樱桃番茄趋势(图2:e～l，图3:e～l，表2)。同时，组织学分析发现，樱桃番茄在小孢子发育初期药隔组织开始向药室内凸，至花粉成熟期约占据药室空间的1/2，而毛酸浆中却无该生物学特征(图2:e～l，图3:e～l)，这可能与物种间进化差异有关，而该结构的生物学功能还有待研究。

茄科(Solanaceae)是80余个属近3000个种的植物大家族，物种间遗传多样性极其丰富。用比较生物学方法研究毛酸浆(P.pubescens)和樱桃番茄花器植物学特征和小孢子发育，对理解茄科植物物种形成、花发育、繁衍和产量形成具有重要的科学意义。