基于EST-SSR标记的南方型黑杨主栽无性系鉴定及亲缘关系分析

袁佳秋 田 野 洑香香

(南方现代林业协同创新中心,南京林业大学林学院,南京 210037)

杨树为杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)树种的统称，是栽培利用价值极高的主要造林树种之一[1]。其中以美洲黑杨(Populusdeltides)和欧美杨(P.×euramericana)为主的黑杨派是中纬度平原地区重要的人工造林树种，目前通过引进和杂交育种获得了大量的无性系后代。早在20世纪70、80年代，I-69杨、I-63杨和I-72杨等多个美洲黑杨和欧美杨无性系就已经成为我国江淮平原及长江中下游地区推广的主栽无性系，并以此杂交出NL-95杨、NL-895杨等速生优良无性系，促进了我国杨树产业的迅速发展[2～3]。黑杨派的早期选育侧重无性系的前期生长速度，推广的品种以雌性为主。近年来，由于雌株飘絮所造成的不利影响，新选育的雄性无性系(NL-3804杨、NL-3412杨等)有逐渐替代原有无性系用于造林的趋势。但这些亲缘关系相近的无性系极为相似，很难从形态学、细胞学或生理学等方面对其进行辨别，这也在一定程度上影响了推广栽培过程中适宜无性系的使用。因此，寻找快速有效的方法对不同无性系进行鉴别，将会为优良无性系的推广应用和规范市场提供依据。

自20世纪90年代以来，分子标记技术的发展为生物种质鉴定提供了新的技术平台，标记手段包括基于杂交的限制性片段长度多态性(RFLP)和基于PCR扩增的随机扩增多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)、简单重复序列区间扩增多态性(ISSR)等[4]。这些分子标记已被广泛应用于杨树的种质鉴定；其中，因SSR标记具有多态性丰富、重复性好、稳定性高等特点，在杨树种内、种间的鉴定分析研究中应用最广泛[5～7]。根据开发标记的来源不同，SSR标记可分为基因组-SSR(gSSR)、转录组SSR和EST-SSR[8]。与gSSR标记相比，EST-SSR标记具有开发简单、成本低廉等特点，而且EST序列的保守程度较高，使该标记具有较好的通用性；并且随着公共数据中EST序列量的不断扩大，为其开发和应用提供了更好的平台[9]。目前，EST-SSR标记在亲缘关系相近的物种间比较作图、遗传图谱的构建、品种鉴定及杂种鉴定等方面具有较高的利用开发的价值[10～11]。

本研究针对江淮流域南方型黑杨主栽区无性系使用混乱且无法有效鉴别的问题，选择自引进以来先后重点推广栽植的12个无性系为材料，基于杨树EST序列开发SSR标记，通过构建其指纹图谱进行无性系鉴定；同时，基于EST-SSR标记位点，对12个无性系的遗传多样性和亲缘关系进行了分析和评价，为主栽区优良无性系的有效保护和推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为12个黑杨无性系(表1)，主要包括我国20世纪70年代起引入的美洲黑杨和欧美杨无性系及后期通过杂交育种选育并在江淮流域重点推广种植的无性系，且目前材料从外观形态上均具有美洲黑杨的特征。于2017年6月，在南京林业大学杨树种质资源圃中采集当年生扦插苗的嫩叶，于-70℃冷冻保存、备用。

1.2 DNA提取与检测

采用试剂盒(TIANGEN-DP350，中国)、CTAB法[12]和SDS法[13]等3种方法提取总DNA，重复3次，无菌水溶解后测定核酸浓度(NanoDrop 2000c，美国)，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测。选最优方法提取的DNA样品，于-20℃保存备用。

1.3 SSR分析

EST序列来自NCBI数据库，采用EST-trimmer软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对杨树EST序列进行分析，用MISA软件找出SSR标记后再利用primer 3在线设计从而获得EST-SSR标记。共30对EST-SSR引物，由擎科生物公司合成。

以4个无性系的基因组DNA作为模板，对所有引物进行初筛。20 μL PCR反应体系包括：2×Taq MasterMix(Takara公司)10 μL，引物各0.25 mol·μ-1，模板DNA 25 ng，ddH2O补足。在ProFlexTMBasePCR扩增仪上进行PCR反应，反应程序[14]：94℃预变性5 min；94℃变性40 s；35个循环包括退火温度55℃，复性30 s，72℃延伸40 s；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行有效性检测，随后采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳[15]检测PCR产物，进行多态性引物筛选。若为多态性引物，则重复3次，来验证扩增产物的稳定性。

1.4 指纹图谱建立及数据处理

利用SPSS 20.1软件中Duncan’s新复极差法对不同DNA提取方法下的DNA浓度进行多重比较。电泳结果采用基因型系统记录谱带位置。根据电泳条带大小，用A、B、C…按条带长度从大到小对条带进行判读和编号，从而建立数据矩阵。利用最少的引物对对12种无性系进行区分，找出不同无性系的特征条带用于鉴定，并绘制指纹图谱。利用Popgene 32软件[16]进行数据处理，分析遗传多样性参数，并利用DPS 7.5软件[17]进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取方法的优化

研究表明，试剂盒法、CTAB法和SDS法提取的DNA浓度分别为150.63～266.70 ng·μL-1(平均为206.31 ng·μL-1)、2 134.13～3 032.36 ng·μL-1(平均为3 032.36 ng·μL-1)和3 410.13～9 364.70 ng·μL-1(4 962.87 ng·μL-1)，后两种方法DNA得率均显著高于试剂盒法，多重比较表明3种提取方法间DNA得率存在显著差异(P<0.05)；同时，3种方法提取的DNA OD260/280均在1.8～2.0，表明DNA纯度均较好。CTAB法较SDS法条带清晰，无拖尾现象，RNA降解完全。综合比较，CTAB法更适合用于本研究SSR分析。

2.2 多态性分析

通过初筛，结果发现有1对引物没有扩增产物，4对引物产生的片段大小远大于预期大小。进一步多态性检验，共获得18对多态性引物，并扩增出88条条带，且扩增产物稳定，重复性好。进一步发现多态性条带为62条，多态性比率为70.5%(表2)；引物扩增条带数在1～12条，平均每个引物扩增4.89条，扩增片段长度为75～625 bp。

2.3 指纹图谱构建及无性系鉴定

通过扩增，获得了一些样品特异性位点，如丹红杨特异性位点EU43-560、I-35杨特异性位点EU11-200等，共5个样本获得7个特异谱带；其它样本则可通过引物组合进行鉴别(图1)。通过综合分析，最少可以利用EU147、EU43、EU11、EU164和EU-81共5对引物构建12个黑杨无性系的EST-SSR指纹图谱(表3)。在该指纹图谱中，每个无性系均可应用特有位点或位点组合加以鉴定(表4)。

表2 18对EST-SSR引物信息及其扩增结果

图1 5对引物在12个南方型黑杨主栽无性系间的扩增图谱 A.引物EU81；B.引物147；C.引物EU11和EU43；D.引物EU164；M. Markers(DL2000)Fig.1 Amplification profiles of 12 southern-type poplar clones with 5 pairs of primers A. Primer EU81; B. Primer 147; C. Primer EU11 and EU43; D. Primer EU164; M. Markers(DL2000)

EST-SSR位点EST-SSR loci条带大小Band size(bp)无性系编号Code of clones123456789101112EU43575————560—540——520——————————484—————EU147250—200—151——————————138————————————EU11281——250——————241——231—————————213—————————200—175———156————138—————120———100————————————80——EU164231—175————————————EU81536————————————500—

表4 基于EST-SSR分子标记的无性系鉴定检索表

表5 EST-SSR扩增位点的遗传参数分析

表6 基于EST-SSR标记计算的12个南方型黑杨无性系遗传相似性和遗传距离

注：右上角.无性系间遗传相似性值；左下角.遗传距离(cM)

Note:Above “****”. Genetic similarity value between different clones; Below “****”. Genetic distance(cM)

图2 基于EST-SSR标记12个南方型黑杨主栽无性系的聚类图Fig.2 Dendrogram of clustering from 12 southern-type poplar clones with EST-SSR

2.4 遗传多样性分析

2.5 黑杨主栽无性系的亲缘关系分析

SSR标记检测到的遗传相似系数为0.602 0～0.904 0(表6)，其中NL-895杨与I-69杨的遗传相似系数最大(0.904 0)，亲缘关系较近，遗传差异较小；而I-63杨和NL-3804杨的遗传相似系数最小(0.602 0)，遗传差异较大，亲缘关系较远。根据树状聚类图，在遗传距离为0.40处，可将12个无性系划分为2大类：NL-3804单独聚为一类，其它无性系聚为另一类。其中，NL-95杨、NL-895杨和I-69杨聚为一小类，这与其相似的亲本遗传信息相吻合；楚林2号和I-72聚为一类，这与两者均具有欧美杨的遗传背景相关(图2)。总体而言，各无性系间的遗传距离均较为接近，与其均具有相似的黑杨遗传背景有关。

3 讨论

3.1 SSR标记扩增产物带型分析

EST-SSR引物的扩增产物一般分为两种情况：一是理想产物与预期产物长度相符合的特异片段；二是长于预期扩增片段的非特异性片段[18]。本研究中发现有大约1/5引物的扩增产物与预期目标产物大小有差别，一方面可能是受EST序列的内含子影响，引物本身的特异性不强[19]；另一方面可能是以基因组DNA(含有内含子)为模板进行扩增的过程中，这些内含子被扩增出来，其产生的多态是内含子长度多态，而不是简单重复序列产生的长度多态[20]。在后续的研究中，需要分析引物对应的EST序列，确定EST序列中是否含有内含子，以进一步确保标记开发的有效性。

3.2 EST-SSR标记多态性分析

多态性是评价分子标记的重要依据。一般认为，EST来自表达基因的编码序列，具有高度保守性，与gSSR标记相比多态性较低[21]。杨新泉等[22]利用这两类SSR标记对我国北方冬麦区的18份普通小麦(TriticumasetivumL.)品种的遗传多样性进行探讨，发现平均每个gSSR检测到的等位基因数(3.34)明显高于EST-SSR(2.31)；宋跃朋等[23]对16个杨树无性系进行遗传差异分析的结果也表明EST-SSR平均检测到的等位基因数(2.8)要低于gSSR所检测到的(4.1)。本研究利用EST-SSR检测到的黑杨的平均等位基因数(2.15)与以上研究结果相近。此外，与其他分子标记的多态性相比，本研究中EST-SSR标记的多态性高于ISSR[24]，但低于SRAP[13]和AFLP[25]。由此可见，本研究中EST-SSR标记的多态性整体较低可能还与试验材料本身遗传差异较小有很大关系，与其他研究中多为派间或种间的材料所体现的高多态性有明显区别，并且这种差异在梨属(Pyrusspp.)研究中也得到证实[26]。

3.3 无性系鉴定效率评价

一般认为，标记的鉴定效率与标记的多态性有关，而多态性则可以反映出检测到的基因型数量情况，其数量越多说明该标记具有较高的鉴别能力[27]。在利用SSR标记进行品种鉴定时，参试标记的多态性越高，其鉴定效率往往也越高[28～29]。本研究通过5对引物可将供试材料完全鉴别(表2)，鉴定效率和冯锦霞等[30]的研究相近，与两个研究所用的材料遗传背景均相近、多态性偏低有关。此外，张亚东等[31]需要利用4对EST-SSR引物，其引物多态率为70.5%，对8个亲缘关系较近的黑杨品种进行鉴别；刘春英[32]需要利用3对SSR引物，其引物多态率为58.3%，建立5个杨树无性系的DNA指纹图谱。进一步说明了种质鉴定效率高低与其多态性高低有关，但在根本上则是受到供试材料亲缘关系远近的影响。由此可见，对于亲缘关系较近的无性系，需要更多的引物来进行分析鉴定以确保品系的优良性[33]。

本研究筛选出18对多态性引物对12个无性系的DNA进行扩增，利用5对引物可将江淮流域主栽的黑杨无性系加以鉴别，表明EST-SSR标记可以作为无性系鉴定的有效手段。将来随着大量杨树EST序列的公布，直接利用EST序列来开发SSR标记将更加简便而且准确，基于EST-SSR标记进行无性系分子鉴定的手段也必将成为无性系鉴定技术发展的一个趋势。