丙炔苯丙胺对帕金森病模型大鼠结肠自噬相关蛋白Beclin1及LC3表达的影响

毕树立，成小华，刘昊，刘斌

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中老年人神经系统变性疾病,主要病变位置在黑质和纹状体,其锥体外系主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常，常伴有便秘等结肠功能障碍[1-2]。PD发生结肠功能障碍的具体机制尚不清楚,有文献报道可能与肠道自噬功能紊乱有关[3]，对于人类而言，自噬引发的肠道疾病和功能失调可能更加危险，因此，自噬参与PD肠道功能失调的研究逐渐引起临床工作者的重视。细胞自噬的形成与多种自噬因子有关，其中自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3, 简称LC3)为重要的细胞自噬因子[4]。丙炔苯丙胺(司来吉兰)是一种常见的单胺氧化酶B拮抗剂，它能够拮抗各种神经毒素对黑质细胞的毒害而起到神经保护作用[5]，进而阻止PD进展，同时对胃功能障碍具有很好的保护作用[6]，但其对PD大鼠模型的结肠功能障碍影响如何尚不明确，本研究通过观察司来吉兰对PD模型大鼠结肠自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达的影响，探讨司来吉兰治疗结肠功能障碍的可能机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只,4～5个月，体质量250～300 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；均饲养于屏障环境动物实验室，室温控制在21～25℃左右，自然光照，先适应喂养2周，再进行试验。(2)药物与试剂：司来吉兰(Orion Corporation Espoo，Finland)，片剂，规格5 mg/片；鱼藤酮粉末，购自北京博奥森生物工程有限公司；葵花油，购自唐山华盛超市；Anti-LC3与Rabbit Anti-Beclin 1购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色液购自北京中杉生物有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白购自华美生物公司；(3)仪器：奥林巴斯BX63全自动显微镜扫描系统购自日本奥林巴斯公司；高速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法 2013年1月—2017年10月唐山市开平医院与华北理工大学附属医院合作实验。大鼠72只按随机数字表法分为假手术组、模型组与干预组，并根据预实验结果，各组大鼠再随机于模型制备成功后4 d和8 d分别取12只进行检测，其中6只以免疫组织化学法检测，6只以Western blot法检测。

1.2.1 PD大鼠模型制备[7]： 因鱼藤酮是脂溶性药物，故应用葵花油将鱼藤酮充分溶解，配制成浓度为2 mg/ml鱼藤酮葵花油溶液，然后充分震荡、混匀，避光保存。模型组与干预组大鼠称质量后，以鱼藤酮2 mg/kg给药。经碘伏消毒后，捏起大鼠的颈背部皮肤，在皮下注射脂溶性药物。参照吕超男等[5]的帕金森病大鼠模型行为学评分标准，进行行为学的检测，大鼠的行为变化被分为6个等级记分：1分，大鼠表现为拒捕的行为减弱，竖毛、毛色变黄、变脏，弓背、主动活动减少；2分，除了有1分表现外，大鼠的自主活动明显减少、动作迟缓，同时具有震颤或步态不稳；4分，具有2分的表现且步态不稳，或不能直线行走，或步行时间向一侧旋转；6分，可向单向斜卧，单侧前肢和/或后肢的瘫痪，行走困难或进食困难；8分，单侧前肢和/或后肢的完全瘫痪，四肢挛缩，体质量明显减轻，均不能进食；10分，濒临死亡或死亡。在行为学上，2～6分之间的大鼠神经细胞缺失相对显著，并且帕金森病动物模型可靠，可作为判定PD模型成功的标志[8]。

1.2.2 干预方法： 当模型制备成功后，每日给假手术组与模型组大鼠灌胃同等量生理盐水，干预组每日灌胃丙炔苯丙胺0.5 mg/kg，每个亚组大鼠分别连续灌药4 d或8 d。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 Beclin1、LC3阳性细胞表达检测：采用免疫组化法检测,按照试剂说明书操作步骤进行。每组随机取6只大鼠，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，行多聚甲醛灌流(浓度4%)后固定，大鼠剖腹后，取结肠1.5～2.0 cm，清除净肠内容物，剪掉肠管多余物质，予4%多聚甲醛溶液分别固定24 h。常规方法包埋、切片、脱蜡、水化和抗原修复；将内源性过氧化物酶用0.3%过氧化氢封闭20 min；1%山羊血清再次封闭 20 min，分别加入一抗(Anti-LC3、Rabbit Anti-Beclin 1)，4℃孵育18 h；加生物素二抗，37℃环境中孵育 25 min；再加辣根酶标记的链酶卵白素，37℃环境中孵育 25 min。以上各步骤分别用PBS 缓冲液浸洗 3 min×3 次。最后行 DAB 显色,光镜下仔细观察。以胞质或胞核呈淡黄色或棕褐色为阳性细胞，在100倍光镜下，随机观察每组大鼠结肠互不重叠的6个视野，进行LC3、Beclin 1阳性细胞计数。

1.3.2 Beclin1、LC3蛋白表达检测： 采用Western blot蛋白印记法检测，取洁净结肠1.5～2.0 cm，立刻投入液氮，在-80℃EP管中保存。将上述冷冻结肠取出，以浓度为40 mg/kg放入蛋白裂解液，电动匀浆，在冰浴环境中静置30 min，离心取上清液，-20℃保存备用。SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗、二抗孵育，以ECL显色，胶片曝光显影，结果用Image J图像程序分析软件分析目的蛋白条带及内参的吸光度值,二者的比值即为相对表达量。

1.3.3 1 h粪便排出量及含水量测定： 参考学者前期研究报道的实验方法[9]，在造模成功后4 d与8 d，各组各取6只大鼠，将每只大鼠单独放于底部铺有滤纸的笼子内，当大鼠排出粪便后，立即收集于1个密闭管中,称质量后即为粪便排出量(湿质量); 在65℃脱水炉中保存12 h，分别称质量即为粪便干质量。粪便含水率(%)=(粪便湿质量-粪便干质量) /粪便湿质量×100%。

2 结 果

2.1 3组大鼠免疫组化检测Beclin1、LC3阳性细胞比较 假手术组大鼠各时间点结肠可见少量Beclin1、LC3阳性细胞的表达。与假手术组比较，模型组各时间点结肠Beclin1、LC3阳性细胞数均显著增加(P<0.01)；与模型组比较，干预组大鼠各时间点结肠Beclin1、LC3阳性细胞数均显著减少(P<0.01)；与4 d时比较，干预组8 d时Beclin1、LC3阳性细胞数显著减少(P<0.01)，而假手术组及模型组不同时点比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 3组大鼠Western blot检测Beclin1、LC3蛋白比较 蛋白质印迹检测结果显示，与假手术组比较，模型组各时间点结肠可见Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表达量较多(P均<0.01)。与模型组比较，干预组各时间点结肠Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表达均减少(P<0.01)。与4 d时比较，干预组8 d时大鼠结肠Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表达量降低(P<0.01),而假手术组及模型组不同时点比较差异均无统计学意义(P>0.05)见表2，图2、3 。

2.3 3组大鼠1 h粪便排出量及含水率比较 注射鱼藤酮35 d左右，大鼠发生了PD行为学改变，其中5只大鼠不能进食水，给予淘汰，另有3只大鼠死亡，均给予补充。1 h粪便排出量及含水率模型组大鼠均低于假手术组(P<0.01)，干预组均高于模型组(P<0.01)；且干预组8 d时高于干预4 d时(P<0.01)，而假手术组及模型组各时点比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 3组大鼠结肠Beclin1、LC3阳性细胞数比较个/HP)

表2 3组大鼠结肠Beclin1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白比较

注：Beclin1相对分子质量为50 000

图23组大鼠结肠Beclin1蛋白比较

注：LC3Ⅱ、LC3Ⅰ相对分子质量为16 000、18 000

3 讨 论

目前PD的肠功能紊乱日益受到临床关注，同时便秘是PD患者肠功能紊乱的最常见主诉[10-11]。有研究结果表明经鱼藤酮葵花油乳液制作的大鼠模型发生了便秘[12]，另一项研究结果证实PD大鼠模型早期发生了便秘[13]，本研究结果中PD模型组大鼠4 d、8 d时的1 h粪便排出量及含水量明显低于假手术组，证明模型组大鼠的肠管蠕动速度明显减慢，PD可能导致肠管功能障碍，这与Fasano等[14]的研究结果一致。

帕金森病患者早期发生便秘的机制尚不明确,可能是多因素交互作用的结果,如结肠多巴胺脱羧酶关键限速酶酪氨酸羟化酶(TH)的减少及α-突触核蛋白(α-Syn)的增多[12]，另一项研究提示单光子发射计算机扫描的多巴胺转运蛋白(DAT)与便秘无关[2]，提示帕金森病患者便秘可能是非多巴胺通路的损害，如氧化应激、细胞凋亡、兴奋性毒性或自噬[3]，自噬可以理解为自食，其结局可导致细胞内一部分受损或多余的老化蛋白和细胞器被吞噬和降解甚至消化，便于细胞生存，同时使机体应对各种应激状态，但当刺激过度或时间较长时，细胞会发生自噬性细胞凋亡，这种表现即可出现于帕金森大鼠模型黑质纹状体内，又可在饥饿大鼠模型心肌中表现[15]。Beclin-1既是调控自噬的关键因子[16]，也是检测自噬活性的重要标志物。Beclin-1主要与Vps34蛋白结合形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3磷酸激酶复合体参与自噬泡的形成[17]。LC3是哺乳动物发生自噬的关键蛋白，其表达形式为LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅰ经过泛素化加工修饰，可与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3Ⅱ并融合于自噬体膜上，参与自噬体的形成，另有研究发现自噬体数量的多少与LC3Ⅱ含量的高低呈正相关，同时Western blot法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也是检测自噬活性最直接的方法。眭怡群等[18]发现在大肠癌组织中Beclin-1、LC3的自噬活性明显上调，提示自噬活性的提高在大肠癌发病过程中可能起着一定作用，吴淑华等[19]发现在大肠癌组织中Beclin-1、LC3蛋白表达量均明显高于癌旁组织，提示过度自噬参与了结肠癌的发病进程。Tusco等[3]发现PD患者发生便秘与肠道发生自噬功能紊乱有关。关永俊等[20]发现大鼠结肠Cajal间质细胞自噬蛋白Beclin-1、LC3表达明显上调，表明Cajal间质细胞发生了过度自噬性凋亡，这可能是大鼠慢传输型便秘的发病机制。本研究发现，PD大鼠模型组Beclin-1、LC3阳性细胞表达数量明显增加，Beclin-1蛋白量、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值显著升高。结果表明，大鼠经鱼藤酮给药后,结肠细胞发生了自噬,在自噬早期,大鼠机体尚能够有效清除结肠神经变性产生的毒性物质,并可能对结肠蠕动有加强作用,但随着疾病的进展,尤其是大鼠达到了帕金森大鼠模型的评分标准后,大鼠机体不能够有效清除大量自噬细胞Beclin-1、LC3产生的毒性物质,导致PD大鼠模型结肠功能紊乱，进而发生了肠功能障碍,最终发生了便秘，进而提示PD模型大鼠结肠过度自噬可能参与了PD大鼠便秘的发生、发展过程。

表3 3组大鼠1 h粪便排出量及含水率的比较

丙炔苯丙胺对多巴胺的分解具有专一抑制性，能够有效稳定脑内的多巴胺水平[21]，同时也能够抑制突触前膜对多巴胺的重新摄取，促进多巴胺的有效释放，并能够延缓左旋多巴的应用时间，进而延缓PD患者临床症状的发生。本研究显示，PD模型大鼠经司来吉兰治疗后，大鼠1 h粪便排出量及含水率显著增加，同时，丙炔苯丙胺干预各亚组Beclin-1、LC3阳性细胞的表达及蛋白的含量均明显减少，说明丙炔苯丙胺可能对结肠过度自噬性细胞Beclin-1、LC3产生的过多的蛋白质或衰老的细胞器具有有效清除作用，并有时间积累效应，使大鼠结肠细胞自噬基础水平趋于稳态，随着大鼠结肠蠕动速度增快，PD大鼠的肠功能障碍得到改善，其作用机制可能与其抑制PD模型大鼠结肠自噬性细胞Beclin-1、LC3的过度自噬有关，且随着治疗时间的延长，效果更明显。这可能为PD患者便秘的防治提供了一定的理论依据。

利益冲突：无

作者贡献声明

毕树立:设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；成小华：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；刘昊、刘斌：提出研究思路，分析试验数据