饲料鱼溶浆影响黄颡鱼的胆汁酸代谢及脂肪沉积

高敏敏 吴代武 周露阳 何 杰 叶元土 蔡春芳 吴 萍郁 浓 孙 飞 张银照 浦琴华

(1. 苏州大学基础医学与生物科学学院, 苏州 215123; 2. 浙江丰宇海洋生物制品有限公司, 舟山 316000;3. 浙江一星实业股份有限公司, 海盐 314300)

胆汁酸(Bile acid, BA)是胆汁的重要组成成分,是胆固醇在代谢过程中所产生的一系列胆烷酸的总称, 一般以钠盐或钾盐的形式存在, 称为胆汁酸盐。胆汁酸合成的经典途径是以胆固醇为原料, 通过一系列酶促反应生成胆酸(Cholic acid, CA)和鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA), 胆固醇7α羟化酶(Cholesteral 7α hydroxylase, CYP7A1)是此反应的限速酶[1]。合成的胆汁酸在肝毛细胆管膜处的胆盐输出泵(Bile salt export pump, BSEP)介导下形成胆汁流, 分泌到毛细胆管, 经胆汁外排进入小肠[2]。胆汁酸在回肠被重吸收入门静脉, 进入血循环。胆汁酸在肝细胞血窦面基底膜上的牛磺胆酸钠协同转运蛋白(Na+-taurocholate contransport peptide, NTCP)介导下被肝细胞所摄取[3], 再经BSEP被分泌入胆小管。胆汁酸从肝脏合成, 贮存于胆囊, 随胆汁分泌入小肠, 在回肠被重吸收再通过门静脉回到肝脏的循环过程称为胆汁酸的肠肝循环[4]。胆汁酸肠肝循环是维持体内胆汁酸池大小稳定的重要调节环节, 也是调节胆汁酸合成速率的重要机制。

牛磺酸是蛋氨酸、半胱氨酸的代谢终产物, 近年来的研究表明牛磺酸在哺乳动物体内具有广泛的生物学功能, 包括: 参与胆汁酸的合成和脂肪的代谢, 促进脂肪的乳化作用和脂类物质(如脂溶性维生素)的消化吸收等。肝脏合成的游离胆汁酸与牛磺酸结合成牛磺胆酸(Taurocholic acid)及牛磺鹅脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid)后, 与BSEP的亲和力增强, 促进了胆汁酸的分泌[5]。随着鱼粉替代蛋白的研究, 牛磺酸在鱼类中的研究也受到广泛地关注, 但主要是探讨其在生长性能、鱼体免疫方面的影响[6], 尚无关于牛磺酸对鱼类胆固醇、胆汁酸代谢的相关报道。胆固醇、胆汁酸的代谢平衡对鱼体健康有重要影响, 高胆固醇会引起脂肪代谢障碍[7]; 而胆汁酸可有效促进鱼体脂肪的代谢,减少组织脂肪沉积[8]。因此, 研究牛磺酸对鱼类胆固醇、胆汁酸代谢的具有重要意义。前期研究发现以鱼粉生产过程中的压榨液浓缩物——鱼溶浆(Stickwater, SW)为蛋白源, 可显著降低黄颡鱼饲料产品中的鱼粉需求量, 但同时, 鱼溶浆会降低鱼体脂肪沉积量[9], 因此本文深入探讨鱼溶浆对黄颡鱼胆汁酸代谢及其组织分布的影响, 为鱼溶浆对鱼类胆固醇、胆汁酸代谢提供科学依据。黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco), 隶属鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus), 是一种优质名贵经济鱼类, 偏肉食性, 具有脂肪含量高的特点, 是研究胆汁酸代谢的优选对象。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼粉为Companfa Pesouera del Pacffico Centro S.A.(Lima, Peru)生产的超级蒸汽鱼粉, 鱼溶浆由浙江丰宇海洋生物制品有限公司提供, 制备过程见Wu等[9]。鱼粉、鱼溶浆主要营养成分见表1。鱼溶浆中牛磺酸水平是鱼粉的5.3倍。

1.2 试验日粮的制备

以30%鱼粉日粮为对照(FM), 在无鱼粉日粮中分别添加约8% (SW8)、17% (SW17)、25% (SW25)的鱼溶浆(干物质), 设计4组等氮等能日粮(表 2)。在试验配方中, 以混合油脂(鱼油∶磷脂油∶豆油=1∶1∶2)平衡各试验日粮脂肪含量, 以磷酸二氢钙保持各试验配方总磷含量, 大豆浓缩蛋白、棉籽蛋白和鸡肉粉同比例变化保持氨基酸平衡, 以米糠粕保持试验日粮配方比例平衡。玉米蛋白粉作为黄颡鱼日粮色素来源而各在配方中保持一致。日粮的制作与Wu等[9]一致, 原料粉碎后过60目筛, 按照表 2进行饲粮原料的配合。用混合机混合均匀后,用华祥牌HKj200制粒机加工成制成直径1.5 mm,长3—5 mm的颗粒饲粮。所有的试验饲粮风干后-20℃密封保存备用。

表 1 试验用鱼粉、鱼溶浆主要成分分析Tab. 1 Chemical composition of experimental fish meal and stickwater (g/100g)

试验日粮营养成分实测值见表 2, 各组间蛋白质、脂肪、总磷、能量水平无显著差异。SW8、SW17和SW25组组胺、腐胺、尸胺较FM组升高明显, SW25组是FM组的21.5、14.0和10.5倍。SW17、SW25组试验日粮牛磺酸水平比FM组高55.6%和88.9%。日粮丙二醛、过氧化值无明显差异, 仅酸价呈现一定程度升高, 表明油脂氧化程度差异性不显著。

1.3 试验鱼与养殖管理

养殖试验在浙江一星养殖基地池塘网箱中进行, 在面积为40 m × 60 m的池塘中设置试验网箱(规格为1.5 m× 1.5 m × 2.0 m) 12个, 以海盐县长山河河水为水源。为保证池塘溶氧均匀, 池塘中间设置1台1.5 kW的叶轮式增氧机, 同时设置1台2.2 kW的微孔增氧鼓风机。每2个网箱之间, 在水下1.8 m的深度放置一个直径为0.5 m的圆形微孔增氧盘(增氧盘由直径20 mm纳米曝气管制成), 投喂期间关闭增氧设备, 投喂前使用微孔增氧1h, 其余时间使用叶轮式增氧。

试验用黄颡鱼苗购自浙江省湖州农业合作社,运输前停食24h。0.3%食盐溶液浸泡15min消毒后,200尾/网分配到试验网箱中暂养, 驯养2周。选取规格整齐的黄颡鱼种, 0.3%食盐溶液浸泡15min消毒后, 随机分成4组, 每组设3个重复(n=3), 共12个试验网箱, 每个网箱46尾黄颡鱼。黄颡鱼初始体重为(15.67±0.11) g。

试验鱼网箱适应2周后开始正式投喂。每天投喂3次(5:30—7:00、12:00—13:30和18:00—20:00),日投喂量为体重的3%—5%, 三餐投喂比例2∶2∶3,每10天估算1次鱼体增重, 调整投喂量, 正式投喂60d。每天6:00和18:00记录池塘水温, 试验期间水温25.5—34.4℃。每5天测定水下30 cm的水环境,养殖期间水体溶解氧浓度＞7.0 mg/L, pH 8.0—8.4,氨氮浓度＜0.10 mg/L, 亚硝酸盐浓度＜0.005 mg/L,硫化物浓度＜0.05 mg/L。

1.4 样品采集

在试验正式开始时, 随机抽取黄颡鱼6尾, 作为初始样本用于全鱼体成分分析。正式养殖试验60d后, 停食24h, 进行试验结束采样工作。包括以下内容: 每个网箱黄颡鱼进行称重, 计算增重率。每网箱随机取4尾鱼保留全鱼样品, 用于体成分分析。随机取10尾鱼, 以1 mL无菌注射器自尾柄静脉采血, 自然凝固30min, 3500 r/min、室温离心10min,取上层血清混合, 液氮速冻后于-50℃冰箱保存, 用于血清生理指标的分析; 解剖10尾鱼取肝胰脏和肠道内容物分别混合, 肝胰脏用于脂肪、胆汁酸测定,肠道内容物胆汁酸含量分析; 每网箱随机取3尾鱼肝胰脏组织小块置于灭酶EP管中, 液氮速冻, 于-80℃保存备用, 用于基因学分析。

1.5 样品分析

主要营养成分原料、日粮、全鱼样品用粉碎机低温粉碎均匀, 用LGJ-18B型冷冻干燥机干燥至恒重测定水分; 凯氏定氮法(GB 5009.5-2010)测定粗蛋白质含量; 索氏抽提法(GB/T 14772-2008)测定粗脂肪含量; GB 5009.4-2010中方法测定粗灰分含量; 采用分光光度法(GB/T 6437-2002)测定总磷的含量; 能量采用XRY-1C型氧弹式热量计测定。

牛磺酸的测定原料、日粮中氨基酸、牛磺酸含量的测定参考吴代武等[10]的分析方法。

生理指标血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇(CHOL)、胆汁酸(BA)和甘油三酯(TAG)采用雅培C800全自动生化分析仪测定。

肝胰脏、肠道内容物与生理盐水1∶9, 组织匀浆, 5000 r/min离心10min。取上清液用雅培C800全自动生化分析仪测定胆汁酸含量。

荧光实时定量 PCR(qRT-PCR)取适量肝脏(不超过100 mg), 液氮研磨成粉末状后, 加入1 mL Trizol (生工)完全覆盖粉末, 待融化后快速转移至1.5 mL RNAase free EP管中, 按照Trizol法提取样本的总RNA。之后采用Prime ScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser (TaKaRa)将RNA反转录成cDNA, 反转录产物稀释后于-20℃保存用于荧光定量分析。

基因序列依据高敏敏等[11]基因测序结果, 利用Primer Premier 5设计定量引物, 引物序列见表 3, 苏州金唯智公司合成。荧光定量采用SYBR Premix ExTaqTMⅡ试剂盒(Takara, Japan), 反应条件为: 预变性95℃ 30s, 变性95℃ 5s, 退火温度20s, 40个循环。溶解曲线程序为: 95℃ 15s, 60℃ 30s, 20min,95℃ 15s。以DEPC水替代模板作为负对照, 采用2-ΔΔCt方法来测定目的基因的相对表达量[12]。

1.6 计算与分析

原始数据经Excel 2003初步整理后, 用SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA), 事后进行Duncan氏多重比较分析试验数据的差异显著性, 结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示, 以P＜0.05为差异显著水平。

2 结果

2.1 黄颡鱼器官组织胆汁酸含量与胆汁酸循环

黄颡鱼肝胰脏、血清、肠道内容物中总胆汁酸含量黄颡鱼肝胰脏、血清、肠道中胆汁酸水平见图 1。SW8和SW17组黄颡鱼肝胰脏、血清、肠道内容物中胆汁酸水平均与FM组无显著差异, 而SW25组肝胰脏胆汁酸水平降低了76.3% (P＜0.05), 血清、肠道内容物中胆汁酸水平分别升高了125.7%、123.3%(P＜0.05)。

图 1 鱼溶浆对黄颡鱼肝胰脏、血清、肠道内容物胆汁酸水平的影响Fig. 1 Effects of stickwater on bile acid in liver, serum, intestine of yellow catfish

胆汁酸肠肝循环代谢关键基因的 mRNA 表达活性无鱼粉日粮中添加8%—25%鱼溶浆对黄颡鱼肝胰脏CYP7A1 mRNA的表达量没有显著影响(P＞0.05, 图 2), 而BSEP、ABCC4、NTCPmRNA的表达量随鱼溶浆添加量增加而呈现上升趋势,SW25组的表达量比FM组高16.9%、68.2%和222.8%,ABCC4、NTCP基因表达量变化显著(P＜0.05)。

结果表明, 无鱼粉日粮中添加8%—17%的鱼溶浆对黄颡鱼肝胰脏胆汁酸的合成没有显著性的影响, 对胆汁酸的分泌作用有显著性的影响。25%鱼溶浆不影响胆汁酸的合成, 但会促进肝胰脏胆汁酸向血液、肠道中转移。

2.2 黄颡鱼鱼体脂肪沉积的变化

鱼溶浆降低黄颡鱼脂肪沉积与FM组相比,黄颡鱼全鱼蛋白质含量不受日粮鱼溶浆添加量影响(图 3), 但全鱼脂肪含量降低, SW25组变化显著(P＜0.05), 肝胰脏脂肪含量变化与之相似, SW17和SW25组变化显著(P＜0.05)。

黄颡鱼血脂含量与转氨酶活性各试验组血清AST和ALT无显著差异(表 4), 表明肝胰脏细胞未受到损伤。SW8组血清CHOL最高, 但与FM组无显著差异(P＞0.05), SW17和SW25组CHOL比FM组低11.9%—16.6%。与FM组相比, 摄食鱼溶浆日粮的黄颡鱼血清TAG水平降低了32.5%—47.9%,SW17和SW25组变化显著(P＜0.05), 血清GLU、HDL和LDL水平无显著差异。结果表明, 在日粮中添加25%鱼溶浆促进鱼体脂肪的代谢过程, 降低脂肪沉积。

3 讨论

3.1 鱼溶浆对黄颡鱼胆汁酸肠肝循环代谢的影响

前期研究发现, 在黄颡鱼日粮中以鱼溶浆为蛋白源, 会降低鱼体脂肪沉积[9], 在此基础上, 本文深入探讨鱼溶浆对黄颡鱼胆汁酸代谢及其组织分布的影响。结果表明, 与鱼粉日粮相比, 无鱼粉日粮中添加25%的鱼溶浆, 肝胰脏胆汁酸水平降低了约76%, 而血清、肠道中胆汁酸水平升高了125%。试验结果表明鱼溶浆的使用是黄颡鱼胆汁酸代谢差异变化的主要原因, 而鱼溶浆中哪些因素会导致胆汁酸代谢的差异? 依据鱼溶浆、试验日粮中主要化学成分的分析, 主要包括小肽、牛黄素胺、生物胺、油脂氧化产物等含量在无鱼粉日粮中存在较大的差异。

图 2 鱼溶浆对黄颡鱼肝胰脏CYP7A1、BSEP、ABCC4、NTCP mRNA的表达量的影响Fig. 2 Effects of stickwater on the expression of CYP7A1, BSEP,ABCC4 and NTCP in liver

高敏敏等[11]的研究表明, 油脂氧化会导致血清胆汁酸水平降低, 在本试验中油脂氧化程度差异较小, 表明油脂氧化不是本试验中黄颡鱼胆汁酸代谢差异性变化的影响因素。各组试验鱼血清AST和ALT无显著差异(表 4), 表明黄颡鱼肝胰脏没有出现损伤, 也不是胆汁酸代谢差异的主要原因。

与鱼粉相比, 鱼溶浆主要含溶解于水中的蛋白质、小肽、生物胺、游离氨基酸等(表 1)。本研究在日粮中添加25%鱼溶浆, 黄颡鱼肝胰脏BSEP表达量上调、肠道胆汁酸水平增加, 是否受组胺等生物胺的影响有待进一步研究。目前很少有生物胺对鱼类胆汁酸代谢的影响见报道, 仅何杰等[13]发现在日粮中添加84.60 mg/kg的组胺不影响黄颡鱼血清胆汁酸、胆固醇含量。有研究表明牛磺酸在胆汁酸代谢过程中具有重要的生物学功能[14—16]。牛磺酸在鱼体大量以游离形态存在, 原料鱼在蒸煮过程中牛磺酸更多的进入压榨液, 所以鱼溶浆牛磺酸含量远高于鱼粉(表 1)。研究表明, 肝脏合成的游离胆汁酸与牛磺酸结合形成牛磺胆酸(Taurocholic acid)及牛磺鹅脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid), 增加日粮牛磺酸供应, 鱼体牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸水平会显著升高[11,17]。肝脏合成的胆汁酸依靠肝毛细胆管膜处BSEP分泌到毛细胆管[2],与游离胆汁酸相比, 结合胆汁酸与BSEP的亲和力增强[5,18]。增加日粮鱼溶浆添加量, 提高牛磺酸供应, 可能导致鱼体牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸水平会升高, 导致肝胰脏BSEPmRNA的表达量上调。BSEPmRNA的上调促进了肝胰脏胆汁酸向胆管分泌, 引起肠道胆汁酸水平的升高, 大量研究也验证了日粮供应牛磺酸会促进胆汁酸的分泌作用[14—16]。胆汁酸的肠肝循环是维持体内胆汁酸池大小稳定的重要调节环节。陈文等[16]的研究表明, 牛磺酸会促进胆汁酸随粪便的排出, 机体以胆固醇的降解来补充胆汁酸的排出, 从而起到降低血清CHOL的作用, 意味着鱼溶浆的使用会导致肠道胆汁酸的流失,这也会在一定程度上促进肝胰脏胆汁酸向肠道的补充分泌。

图 3 鱼溶浆对黄颡鱼体成分的影响Fig. 3 Effects of stickwater on weight gain and body composition of yellow catfish

表 4 黄颡鱼血清生理指标Tab. 4 Serum physiological indexes of yellow catfish

ATP-结合盒转运蛋白C4 (ATP Binding Cassette Transporter C4, ABCC4), 也称多药耐药相关蛋白4 (Multidrug resistance-associated protein 4,MRP4), 位于肝细胞基底膜上, 大量动物实验证明ABCC4对胆汁酸向血液转移具有重要生理作用[19,20]。在哺乳动物的研究发现, 肝脏ABCC4蛋白表达上调使胆汁酸改道向血液转移, 最终随尿液排出体外[21,22]。与BSEP相比, ABCC4与结合胆汁酸亲和力更强[23],故ABCC4表达量随鱼溶浆添加量增加而上调,25%鱼溶浆影响显著, 导致了肝胰脏胆汁酸向血液转移, 血清胆汁酸水平显著高于鱼粉组。

血循环中的胆汁酸可在肝细胞血窦面基底膜上的NTCP介导下被肝细胞所摄取[3], 日粮添加25%的鱼溶浆导致肝胰脏胆汁酸向肠道、血液转移、降低了肝胰脏胆汁酸的含量, 使NTCPmRNA的表达量上调, 促进了胆汁酸的重吸收作用。为了验证肝胰脏胆汁酸水平的降低是否会促进胆汁酸的从头合成, 我们分析了胆汁酸合成限速酶[1]——CYP7A1 mRNA的表达水平, 结果发现鱼溶浆并不会影响胆汁酸的合成作用。Liaset等[24]发现高牛磺酸的酶解鱼浆有降低CYP7A1 mRNA表达量的趋势, 而胆汁酸的合成量没有变化。陈文等[16,25]认为牛磺酸仅在有外源胆酸盐的条件下才会诱导CYP7A1的大量表达, 但其诱导机制尚不清楚。总之, 鱼溶浆促进肝胰脏胆汁酸向肠道、血液的分泌, 而胆汁酸的合成能力没有增强, 当肝胰脏从血液重吸收的胆汁酸不足以弥补自身损失时, 便导致了肝胰脏胆汁酸水平的下降。

3.2 鱼溶浆对黄颡鱼脂肪沉积代谢的影响

胆固醇、胆汁酸的代谢平衡对鱼体健康有重要影响, 高胆固醇会引起脂肪代谢障碍[7,26]; 而胆汁酸可有效乳化脂肪, 促进鱼体脂肪的代谢, 减少组织脂肪沉积[8,27]。TAG、CHOL是体内重要的脂类物质, 血清CHOL的增高常伴随TAG的增高[28]。脂肪组织是体内最大的CHOL储存池, 而血清CHOL水平反映了脂肪吸收、代谢状况[29]。血清CHOL过高会引起脂肪代谢障碍, 陈强等[26]发现血清CHOL增加会造成肝脏CHOL的过度积累, 病变肝脏(花肝、土肝、绿肝等)的比例上升。在本研究中, 添加25%的鱼溶浆, 黄颡鱼血清TAG、CHOL均低于鱼粉组, TAG降低显著, 表明鱼溶浆可有效促进脂肪的代谢, 而全鱼和肝胰脏的脂肪含量降低,意味着鱼溶浆对降低鱼体脂肪沉积有显著影响。前期研究也发现草鱼日粮中鱼溶浆添加量增加, 血清CHOL、TAG呈降低趋势[30], 与本研究结果相似。这可能与鱼溶浆中牛磺酸含量高有关, 研究表明牛磺酸参与胆汁酸的合成和脂肪的代谢, 促进脂肪的乳化作用和脂类物质(如脂溶性维生素)的消化吸收等, Li等[31]的研究表明牛磺酸可有效降低血清CHOL和TAG水平。

HDL和LDL是CHOL的主要运输者[32], 分别将CHOL运入和运出肝脏, 血清LDL与CHOL水平正相关[28], 草鱼日粮中添加6%的鱼溶浆使血清HDL升高而LDL降低, 但未出现显著变化[30], 在本试验中HDL和LDL无显著变化, 表明25%的鱼溶浆对血清HDL和LDL影响不显著。

4 结论

无鱼粉日粮中添加25% 鱼溶浆(干物质), 对黄颡鱼胆汁酸的合成没有显著影响, 但促进了胆汁酸从肝胰脏向血液、肠道中转移; 牛磺酸可能是引起胆汁酸代谢变化的主要因素之一; 鱼溶浆促进了鱼体脂肪的能量代谢作用, 降低全鱼、肝胰脏脂肪沉积量。