成纤维细胞生长因子 FGF11、13、18对小鼠毛囊第一生长周期作用的研究

曹校瑞,高淑媛,牛 姝,程笳琪,赫晓燕

(山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801)

毛囊是皮肤重要而复杂的附属结构,是一个再生组织,不断经历生长期、退化期和静止期3个时期,这个过程叫做毛发周期。其中,小鼠出生后1～23 d为毛囊的第一生长周期,其中1～12 d为生长期,13～18 d为退化期,19～22 d为静止期,23 d毛囊进入再生长期。毛囊第一生长周期作用过程复杂,由多种酪氨酸蛋白激酶受体生长因子调节,包括胰岛素生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子。成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGF)家族的成员参与很多不同类型细胞的增殖、迁移、分化和存活,参与控制血管生成[1-2],通过与其受体FGFR结合来进一步调控毛发的生长。

FGF11和FGF13都是FGF11亚家族的成员,在舌头发育中,FGF11和 FGF13都有表达,其中FGF11作用有限,FGF13可能参与间叶细胞增殖和分化[3],但FGF13的功能基本上仍是未知的,FGF13在胚胎中枢和周围神经系统也有显著广泛的表达[4]。FGF18属于FGF8亚族的一员,FGF18是多向性的生长因子,可以刺激间叶细胞、上皮细胞和组织的增殖,如肺、肾、心、睾丸、脾脏、骨骼、肌肉和大脑[5]。然而FGF11在皮肤毛囊形成和发育过程中作用的研究从未报道过,有报道提到FGF13在出生后1～4 d的新生小鼠皮肤毛囊隆起部和基底层高表达,FGF18信号在成年小鼠毛囊发育静止阶段维持毛囊干细胞的静止状态,促进毛囊从静止期向生长期过渡[6-10]。但是在出生后小鼠毛发生长发育第一个周期中,这3个生长因子是如何表达的,起到什么作用,还没有系统全面的研究过。本试验首先采用免疫组化技术检测FGF11、FGF13和FGF18蛋白在小鼠毛囊第一生长周期的背部皮肤中的分布,其次采用实时荧光定量PCR技术从基因水平检测FGF11、FGF13和FGF18基因在小鼠毛囊第一生长周期背部皮肤中的表达量,最后通过蛋白免疫印迹技术检测FGF11、FGF13和FGF18蛋白在小鼠毛囊第一生长周期背部皮肤中的表达量。旨在探究FGF11、FGF13和FGF18对小鼠毛囊第一生长周期的影响,为研究毛发生长机制提供一定的理论基础。

1 试验材料

1.1 试验动物及取材 从山西医科大学购买ICR小鼠(动物合格证号：0107010),饲养一段时间,待小鼠适应新环境后,进行合笼。从观察到阴道栓开始记怀孕天数。 取出生后 3、5、8、13、16、18、20 d 和23 d小鼠背部皮肤,每次随机选取3只日龄相同的小鼠的皮肤组织,每只小鼠背部皮肤取若干分为三部分,其中一部分先用Bouin氏固定液进行固定,随后进行组织包埋。剩下二部分放入液氮中保存。

1.2 主要试验药品、试剂与耗材 FGF11兔抗多克隆抗体(Biorbye,Orb101545)、FGF13兔抗多克隆抗体(Abcam,Ab153808)、FGF18兔抗多克隆抗体(Biorbye,Orb1778)、兔 Streptavidin-HRP试剂盒(康为公司)、TRIZol Reagent(Invitrogen公司);SYBR PremixEx TaqⅡ、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)等。

2 方法

2.1 免疫组化

2.1.1 石蜡切片的制备 常规方法制片,片厚6 μm。试验组织修整→脱水、透明→浸蜡→包埋→修块→切片、展片、烤片→做好标记,放入切片盒备用。

2.1.2 免疫组织化学试验 采用免疫组化试剂盒,按说明书进行试验。切片脱蜡与复水→封闭→阳性组滴加兔抗 FGF11(1∶150)、FGF13(1∶200)、FGF18(1∶200)、对照组滴加同等体积PBS缓冲液→4℃过夜孵育→磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗→滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液,孵育10 min→PBS缓冲液冲洗→滴加链酶亲和素(SABC)→PBS缓冲液冲洗→二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)+H2O2显色→苏木精染色→封片→观察,采集图像,每个样品取6张切片,每张切片选取五个视野。

2.1.3 图像采集与数据分析 使用图像分析软件Image-pro plus6.0,对每张切片采集的5个视野进行分析,得出每个样品的阳性反应平均光密度值。使用SPPS17.0软件分析统计表得到每组值的均值和标准偏差,进行方差分析。

2.2 实时荧光定量PCR

2.2.1 小鼠背部皮肤总RNA及cDNA的提取 采用TRIZol法,提取出生后小鼠背部皮肤总RNA,使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。反应完成后,测量浓度,放在-20℃保存。

2.2.2 PCR引物的设计及扩增 登录NCBI查询小鼠FGF11、FGF13、FGF18及内参β-actin基因的序列,用Primer 5软件设计引物,引物序列如下：

将上述引物送华大基因科技服务有限公司合成,之后进行普通PCR扩增,切胶条送华大基因科技服务有限公司测序。测序成功后进行实时荧光定量PCR。

2.2.3 荧光定量 PCR检测 FGF11、FGF13、FGF18在出生后小鼠皮肤中的表达 利用实时荧光定量PCR检测FGF11、FGF13、FGF18在出生后小鼠皮肤中的表达。以反转录得到的cDNA为模板,β-actin作为内参基因及上述引物进行荧光定量PCR扩增。制备好反应体系后在StepOnePlus Real-Time PCR中进行扩增。按照RT-PCR Kit说明书操作,每个样品4个重复,反应体系为10 μL。反应条件：预变性95℃ 30 s,95℃ 5 s,57℃ 30 s,72℃ 15 s,循环数为40个,终延伸72℃ 10 min。试验数据采用2-ΔΔCT,所有数据用SPSS 17.0进行统计分析,荧光实时定量 PCR结果均用均值±标准差(Means±SD)表示,其中各基因的表达量所示结果均由内参基因β-actin的表达量进行校正,所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析检验。

2.3 蛋白免疫印迹技术

2.3.1 出生后小鼠背部皮肤总蛋白的提取 根据总蛋白提取试剂盒的试验步骤说明书提取皮肤组织的总蛋白,测定浓度后将样品放入-80℃保存。

2.3.2 蛋白免疫印记(Western Blot)每个样品总蛋白上样量为300 μg,每个样品3个重复,根据浓度算出体积。总体系30 μL,之后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经制胶和加样、电泳和转膜后,在孵育盒中配制抗体 FGF11(1∶300)、FGF13(1∶400)、FGF18(1∶300)进行4℃过夜孵育后得出含有蛋白印记的NC膜,按照eECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒说明书配制发光液,均匀涂在NC膜上,用凝胶成像仪曝光,暗室压胶片。

2.3.3 蛋白免疫印记图像分析 利用Image J分析FGF11、FGF13、FGF18蛋白和β-actin蛋白条带灰度值,然后用软件分析数据。

3 结果

3.1 免疫组织化学结果 免疫组织化学结果显示,在小鼠背部皮肤真皮乳头、毛基质、外根鞘、膨大部、皮脂腺和表皮均有FGF13的免疫阳性反应,主要在细胞质中表达,在阴性对照组均未见FGF13的阳性反应(见中插彩版图1 A-D a-d)。在小鼠背部皮肤真皮乳头、毛基质、内根鞘、外根鞘、皮脂腺、膨大部和表皮均有FGF18的免疫阳性反应,在细胞质和细胞核中都有表达,在阴性对照组均未见FGF18的阳性反应(见中插彩版图1 E-H e-h)。在小鼠背部皮肤真皮乳头、毛基质、内根鞘、外根鞘和皮脂腺均有FGF11的免疫阳性反应,在阴性对照组均未见FGF11的阳性反应(见中插彩版图1 I-L i-l)。 FGF11、FGF13、FGF18 的光密度值见表 1。

表1 出生后小鼠背部皮肤FGF11、13、18蛋白阳性反应物平均光密度值

3.2 RT-PCR结果 如图2,经过PCR仪扩增,得到大小分别为109 bp、121 bp、132 bp 的 FGF11、FGF13、FGF18基因核酸片段。在NCBI将测序结果序列比对后确实为小鼠的FGF11、FGF13、FGF18基因。

图1 FGF13、FGF18、FGF11蛋白在出生后小鼠背部皮肤中的表达

图2 FGF11、FGF13、FGF18基因PCR扩增产物

通过 RT-PCR实验测定了 FGF11、FGF13、FGF18基因在小鼠背部皮肤中的相对表达量,β-actin作为内参基因。利用2-ΔΔCT法得于出生后小鼠皮肤FGF11、FGF13、FGF18 mRNA的相对表达量,出生后3天的相对表达量为对照组,其统计图见图3,出生后FGF11 mRNA在5日龄表达量最高,在生长期表达量逐渐下降;FGF13 mRNA表达量在生长期逐渐下降,静止期及退化期逐渐上升;FGF18 mRNA表达趋势与FGF11相似。

3.3 蛋白免疫印迹结果 通过Western Blot检测FGF11、FGF13、FGF18在小鼠背部皮肤组织中的表达量发现：在不同日龄小鼠背部皮肤中均有FGF11、FGF13、FGF18蛋白的存在,大小依次为 25 kDa、25 kDa、28 kDa,出生后,FGF11在5日龄表达最高,但是整体并没有一定的趋势;FGF13在3日龄表达最高,13日龄表达最低,从16日龄表达量开始上升;FGF18在3日龄小鼠背部皮肤中表达量最高,16日龄最低,从18日龄开始表达量又开始上升。其条带见图4,蛋白分析统计见图5。

图3 出生后小鼠背部皮肤FGF11、FGF13、FGF18和β-actin基因相对表达量统计

图4 出生后小鼠背部皮肤FGF11、FGF13、FGF18和β-actin的曝光条带

图5 FGF11、FGF13、FGF18在出生后小鼠背部皮肤组织中蛋白印记分析统计图

4 讨论

出生后,毛囊出现周期性的活动模式,这种循环模式被称作是毛发周期[11]。本试验首先选取出生后1～23 d的小鼠背部皮肤,包埋后通过H.E.染色技术观察其形态结构,选取出生后3 d、5 d、8 d、13 d、16 d、18 d、20 d 和23 d 的小鼠,其中,3 d、5 d、8 d 毛囊分别处于生长期;13 d、16 d、18 d 毛囊处于退化期;20 d毛囊处于静止期;23d毛囊进入再生长期。

IHC-P试验显示,FGF11表达于小鼠背部皮肤真皮乳头、毛基质、内根鞘、外根鞘和皮脂腺,且在细胞质和细胞核都有表达,有试验证明,FGF11是细胞内蛋白,主要在细胞核内结合和控制电压门控通道,进而在某些促有丝分裂和细胞存活的相关活动中发挥作用[12]。光密度统计、RT-PCR、WB结果均显示FGF11的表达量忽高忽低,没有发现一定的规律。表明FGF11对于出生后小鼠背部皮肤毛囊生长周期可能没有明显和特定的调节作用。不过,在生长期Ⅲc(5 d)和退化期Ⅲ(16 d),FGF11的表达量分别高于生长期和退化期的其他阶段,其原因需要今后试验的进一步研究。

IHC-P试验得出,小鼠背部皮肤真皮乳头、毛基质、内根鞘、外根鞘、膨大部、皮脂腺和表皮均有FGF13的免疫阳性反应,主要在细胞质中,在膨大部的阳性免疫反应较强,内根鞘免疫阳性反应很弱。RT-PCR实验显示,FGF13 mRNA从3 d开始一致下降,在13 d表达量最低,从16 d开始表达量上升。Western Blot试验显示的FGF13蛋白表达趋势与定量表达趋势一致。结果提示,FGF13在膨大部表达量高,这与前人所提出的试验结果一致,而毛囊干细胞主要位于膨大部,干细胞以循环的方式不断处于活跃和静止状态,说明FGF13对于毛囊的自我更新有一定的作用;且FGF13在生长期表达量较高,退化期表达量降低,静止期表达量增加,再生长期表达量又升高,说明FGF13可能诱导毛囊从静止期向再生长期过渡,可以促进对毛囊生长,可能的解释是,毛囊进入再生长期主要取决于自主的、依赖于固有的信号和非自主的、因周围大环境激活剂传递过来的信号,而静止期FGF13信号增强,超过了毛囊干细胞活跃的阈值,刺激毛囊干细胞激活,进而进入了再生长期。

FGF18可能诱导真皮乳头细胞分泌生长因子影响毛囊细胞,或可能会作用于血管内皮细胞影响血液循环[13]。Kawano M等人的研究发现,当生长期皮下注射FGF18,基质细胞增殖立刻被抑制,毛囊生长强烈被抑制。相比之下,当静止期皮下注射FGF18时,没有迅速的反应,但是经过一段时间后(3～8周),实验组毛发生长早于对照组,对照组皮下注射的是磷酸盐缓冲溶液[14]。Kimura-Ueki M等人试验敲除FGF18,显示出静止期缩短[15]。而且,真皮乳头的FGF18在静止期早期表达量多于晚期。还有研究说对体外膨大部干细胞FGF18是抑制效应。本试验没有添加或者敲除FGF18,是研究了毛囊正常发育过程中FGF18的表达情况。IHC-P试验得出,在小鼠背部皮肤真皮乳头、毛基质、内根鞘、外根鞘、膨大部、皮脂腺、膨大部和表皮均有FGF18的免疫阳性反应,在细胞质和细胞核中都有表达,但是内根鞘阳性免疫反应物较少,在外根鞘阳性反应物较高。RT-PCR试验显示,FGF18 mRNA从3 d表达量开始逐渐降低,到了16 d降到最低,18 d开始上升。Western Blot试验显示,FGF18蛋白表达趋势与定量表达趋势一致。结果提示,FGF18在生长期期间的表达量从高到低,退化期表达量降到最低,静止期表达量又增加,再生长期表达量高于静止期,可见由于FGF18信号的增加,毛囊进入了再生长期,试验得出FGF18在毛囊循环周期中在静止期向生长期过渡期有一定的作用,可以促使毛囊从静止期进入再生长期,可能是因为FGF18诱导真皮乳头细胞分泌生长因子,影响毛囊细胞,也可以刺激真皮成纤维细胞,乳头细胞以及表皮角化细胞的DNA合成。

5 结论

5.1 通过 NCBI设计了小鼠 FGF11、FGF13和FGF18的特异性引物,通过PCR技术进行扩增,得到大小分别为109 bp、121 bp、132 bp的基因片段。

5.2 在小鼠毛囊生长第一个周期,FGF11可能没有明显和特定的调节作用;FGF13可能对于毛囊的自我更新有一定的作用,诱导毛囊从静止期向再生长期过渡,促进毛囊生长;FGF18在毛囊从静止期向生长期过渡期有一定的作用,可以促使毛囊从静止期进入再生长期。