12种竹笋蛋白对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用

杨慧敏 吴良如 杨金来

摘要 [目的]探讨不同种类竹笋蛋白的抗癌活性。[方法]采用植物活性蛋白提取试剂盒提取竹笋蛋白，CCK-8法检测不同浓度竹笋蛋白对胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖抑制作用，72 h后显微拍照记录细胞生长情况，并计算IC50值。[结果]12种竹笋蛋白在体外均可强效抑制胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖，但抑制效果并不完全相同，在一定范围内，其抑制率与浓度呈正相关，呈现一定的剂量-效应关系。[结论]12种竹笋蛋白对肿瘤细胞，如胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖均有显著的抑制作用，为今后进一步研发竹笋源的低毒、高效的抗肿瘤药物奠定基础。

关键词 竹笋蛋白;人胃癌细胞SGC-7901;人结肠癌细胞HCT-116;增殖;抑制

中图分类号 Q 946.1  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）12-0181-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.050

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to investigate the anticancer activity of proteins of different species of bamboo shoots.[Method]The proteins of bamboo shoots were extracted with the plant active protein extraction kit.CCK8 assay was used to detect the inhibitory effect of proteins of bamboo shoots with different concentrations on the proliferation of gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116.After 72 h，the growth of cells was observed and photographed by microscope，and its IC50 value was calculated.[Result]All proteins of the 12 kinds of bamboo shoots could strongly inhibit the proliferation of gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116 in vitro，but the inhibitory effect was not completely the same.Within a certain range，the inhibitory rate was positively correlated with the concentration，showing a certain doseeffect relationship.[Conclusion]All proteins of the 12 kinds of bamboo shoot have significant inhibitory effects on the proliferation of tumor cells，such as gastric cancer cell SGC7901 and colon cancer cell HCT116，which provide a foundation for further research and development of the low toxicity and high efficiency antitumor drugs from bamboo shoots.

Key words Bamboo shoot protein;Gastric cancer cell SGC7901;Colon cancer cell HCT116;Proliferation;Inhibition

惡性肿瘤是危害人类生命和健康的严重疾病之一，从天然产物中筛选出能与癌症发生、发展、形成等过程中各调节靶点特异结合的活性成分，已成为寻找抗癌药物的新热点。近年从植物中发现了越来越多的抗肿瘤活性蛋白或多肽，已成为药物研发中的一个活跃领域。Porro等[1]将从苦瓜中分离出的蛋白与抗CD5单克隆抗体偶联，结果表明，偶联后的苦瓜蛋白在体外可抑制外周血单核细胞及人T细胞蛋白和 DNA的合成，并能抑制白血病小鼠病情的发展，有效率达80%;陈元[2]从蓖麻中分离到一个66 kD的蓖麻毒蛋白，该蛋白是一种广谱型抗癌活性蛋白，对食道癌细胞EC109 和肝癌细胞 SMM7721 具有直接杀伤作用，并且在低剂量时就可以使癌细胞发生凋亡。一般认为植物源活性蛋白主要通过直接杀死肿瘤细胞和促进癌细胞凋亡[2];抗突变和抑制癌细胞扩散抑制肿瘤细胞的增殖[3];抑制蛋白质的合成抑制肿瘤细胞的增殖[4];抑制相关酶的活性抑制肿瘤细胞的转移等途径发挥抗肿瘤的作用[5-6]。

竹笋是从竹子根状茎上萌发分化而成的膨大的芽和幼嫩的茎。Wang等[7]从麻竹笋中分离到一种20 kD的抗真菌蛋白Dendrocin，它能抑制菌丝体的生长，经分析N端序列发现其与类甜蛋白相似，但分子量更小些，且这种蛋白不像其他抗菌蛋白一样具有红细胞凝集和核糖核酸酶活性;Maekawa等[8]从竹笋中分离到3个与酪蛋白激酶 Ⅱ 相关的60S酸性核糖体P蛋白（13、15和35 kD）具有很强的体内磷酸化抑制作用。笔者曾就24个不同种属的竹笋蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖活性进行研究，结果发现，24种竹笋蛋白在体外均可不同程度地抑制人胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖，并呈现出一定的浓度依赖关系[9]。基于此，该研究将对另外12种不同种属的竹笋蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖活性进行研究，试图从中筛选出对肿瘤细胞抑制作用更强的竹笋蛋白，为今后开发低毒、高效的抗肿瘤活性竹笋蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 竹笋。

桂竹、斑竹、唐竹、茶竿竹于2017年4月采集自临安竹种园，撑绿竹3号、粉单竹、黄麻竹、吊丝单竹、马来甜龙竹、勃氏甜龙竹、毛脚龙竹于2017年8月采集自福建永安竹种园，于-80 ℃中保存备用。

1.1.2 肿瘤细胞。人胃癌细胞株SGC-7901和人结肠癌细胞株HCT-116均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（http：//www.cellbank.org.cn/）。

1.1.3 主要试剂及试剂盒。胎牛血清（货号：SH30396.03）和RPMI-1640培养基（货号：SH30809.01）均购自Hyclone公司;CCK-8细胞增殖活性检测试剂盒（货号：CK04）购自日本DOJINDO 公司;改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒（货号：C503041）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4 主要仪器设备。

高通量组织研磨仪，Tissue Lyser Ⅱ，德国QIAGEN公司;酶标仪，800TSNB，美国BioTek公司;二氧化碳细胞培养箱，BC-J80SAB104-N，上海博讯实业有限公司;显微镜，BX53，日本奥林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养。

复苏胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116，采用RPMI1640培养基接种至细胞培养瓶，并置于5% CO2、 37 ℃二氧化碳培养箱中培养至对数生长期备用。

1.2.2 竹笋蛋白提取。

称取0.8 g竹笋，剪碎后平均分装到3～4管2 mL离心管中，加10% PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）和2颗5 mm磁珠，再加1.5 mL有SDS蛋白裂解液（含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%NP-40、20 mmol/L Tris，pH 8.0～8.5）、终浓度为1 mmol/L的PMSF（苯甲基磺酰氟）、2 mmol/L的EDTA，混匀，置于冰上5 min后，加入终浓度10 mmol/L DTT（二硫苏糖醇）。利用组织研磨仪Tissue Lyser Ⅱ 破碎组织（120 s，60 Hz），取出磁珠，4 ℃，15 000 r/ min×离心20 min。将全部上清液转入新的50 mL离心管中，加入5倍体积的10%冷TCA（三氯乙酸）/丙酮，加入终浓度10 mmol/L DTT，捣碎沉淀于-20 ℃放置2 h或过夜，12 000 r/min，4 ℃、离心20 min，弃上清。将沉淀转入新的2 mL离心管中，加1 mL冷丙酮，加入终浓度10 mmol/L DTT，捣碎沉淀，于-20 ℃放置2 h后，15 000 r/min，4 ℃離心20 min，弃上清，重复此步骤，直至上清无色。风干沉淀，加入适量有SDS 蛋白裂解液，加1颗5 mmol/L磁珠，采用Tissue Lyser Ⅱ 振荡（120 s，40 Hz），4 ℃，15 000 r/min离心15 min，弃上清。加入终浓度10 mmol/L DTT，56 ℃水浴1 h。冷却至室温，加终浓度55 mmol/L IAM（碘乙酰胺），暗室放置45 min。加入5倍体积冷丙酮沉淀样品2 h，4 ℃、15 000 r/min离心15 min，弃上清。风干沉淀，加入适量无SDS L3裂解液，加1颗5 mm磁珠，采用Tissue Lyser Ⅱ 振荡（120 s，40 Hz）、4 ℃、15 000 r/min离心15 min，上清即为竹笋蛋白质溶液。Bradford法测定蛋白液浓度，并分装保存于-80 ℃。

1.2.3 竹笋蛋白孵育胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116。

将胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116细胞计数，按每孔3 000个细胞接种于96孔板，置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，待细胞密度长至60%～70%时将竹笋蛋白按0.02 mg/mL与培养基一起作用于上述细胞，72 h后显微拍照，记录细胞生长状况。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖活性。

细胞用竹笋蛋白（试验前将竹笋蛋白用完全培养基按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50和1∶100的比例稀释）处理72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，混匀后培养箱中孵育1.5 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度，按照以下公式计算细胞增殖抑制率：

抑制率 =（1-竹笋蛋白作用OD值/阴性对照OD值）×100%。

1.2.5 IC50值（半数抑制率）的计算。采用GraphPad Prism 软件，根据上述各梯度浓度的增殖抑制率，计算其IC50值。

1.2.6 统计学分析。

所有试验数据均采用SPSS v21.0（http：//spss.en.softonic.com/）统计学分析软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 12个竹种的分类信息

为了探讨不同竹种的竹笋蛋白对胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116增殖的影响，选取了12个竹种进行研究。根据1996《中国植物志》第9（1）卷，其分类信息如表1所示[10]。

2.2 不同浓度竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖的抑制作用

将不同浓度竹笋蛋白作用于人胃癌细胞SGC-7901 72 h后，CCK-8法检测细胞增殖情况，结果如图1所示，12种竹笋蛋白均可抑制SGC-7901细胞增殖，在一定浓度范围内，浓度越高抑制作用越明显;其中绿皮黄筋竹、撑绿竹3号、粉单竹、黄麻竹、吊丝单竹、马来甜龙竹和勃氏甜龙竹的竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率呈正相关关系，随蛋白浓度的增加对肿瘤细胞增殖的抑制作用越明显，呈现显著的剂量-效应关系;而桂竹、斑竹、唐竹、毛脚龙竹和茶竿竹的竹笋蛋白到达一定浓度后对细胞增殖的抑制作用趋于平缓。

2.3 不同浓度竹笋蛋白对结肠癌细胞株HCT-116细胞增殖的抑制作用

将不同浓度竹笋蛋白作用于结肠癌细胞株HCT-116 72 h后，CCK-8法检测细胞增殖情况，结果如图2所示，12种竹笋蛋白中均可抑制结肠癌细胞株HCT-116的增殖，在一定浓度范围内，浓度越高抑制作用越明显;其中绿皮黄筋竹、撑绿竹3号、粉单竹、黄麻竹、吊丝单竹、马来甜龙竹和勃氏甜龙竹的竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率呈正相关，呈现一定的剂量-效应关系;而桂竹、斑竹、唐竹、毛脚龙竹和茶竿竹的竹笋蛋白到达一定浓度后抑制结肠癌细胞株HCT-116的增殖作用趋于平缓。

2.4 12种竹笋蛋白对胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116增殖的影响

在一定浓度范围内，这12种不同种类的竹笋蛋白均可抑制SGC-7901和HCT-116细胞增殖。为进一步验证这种抑制作用，将提取的稀释成不同浓度的12种竹笋蛋白作用于SGC-7901和HCT-116细胞株72 h后，采用光学倒置显微镜观察细胞的生长情况，加以验证其对肿瘤细胞增殖活性的影响。

从12种提取的竹笋蛋白原液稀释5倍后作用于胃癌细胞株SGC-7901培养72 h后显微镜下的细胞生长情况（图3）可以明显地看到，与CK对照组细胞形态饱满、结构完整相比，12种竹笋蛋白作用于胃癌细胞株SGC-7901后，细胞数量显著减少，且大部分细胞形态发生明显改变，细胞体积缩小，胞核呈致密浓染，失去正常形态，呈半月状或碎块状，表现为典型的细胞凋亡或细胞坏死状态，尤其桂竹、斑竹、唐竹、毛脚龙竹和茶竿竹，表明12种竹笋蛋白原液稀释5倍后均可抑制胃癌细胞株SGC-7901的增殖，与CCK-8的检测结果一致。

从12种竹笋蛋白原液稀释5倍后作用于结肠癌细胞株HCT-116培养72 h后显微镜下的细胞生长情况（图4）可以看出，与CK对照组相比，12种竹笋蛋白作用于结肠癌细胞株HCT-116后，细胞数量显著减少，且细胞形态发生明显改变，细胞体积缩小，形态改变或细胞破碎，尤其桂竹、斑竹、唐竹、毛脚龙竹和茶竿竹作用组表现出典型的细胞坏死状态，表明12种提取的竹笋蛋白原液稀释5倍后均可抑制结肠癌细胞株HCT-116的增殖，与CCK-8的检测结果一致。

2.5 12种竹笋蛋白对胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的半数抑制浓度

根据各不同梯度浓度的竹笋蛋白作用于肿瘤细胞的不同增殖抑制率，采用GraphPad Prism 软件，计算IC50值，见表2。IC50值作为抑制能力的最终指标，一般认为，IC50值若2  mg/mL< 85%，则视为无效;若2  mg/mL≥85%或1  mg/mL>50%，視为弱效;若1  mg/mL≥85%或0.5  mg/mL>50%，则为强效抑制[11]。IC50的数值越小，说明其抑制肿瘤细胞增殖的作用越强。由表2可知，12种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116增殖的抑制作用都属于强效的;对胃癌细胞株SGC-7901抑制作用最强的是唐竹，其次是桂竹，然后依次是茶竿竹、斑竹、毛脚龙竹、吊丝单竹、马来甜龙竹、绿皮黄筋竹、粉单竹、黄麻竹、撑绿竹3号，抑制作用最弱的是勃氏甜龙竹。对结肠癌细胞株HCT-116抑制作用最强的是毛脚龙竹，其次是桂竹，然后依次是斑竹、唐竹、茶竿竹、马来甜龙竹、吊丝单竹、黄麻竹、撑绿竹3号、勃氏甜龙竹、绿皮黄筋竹，抑制作用最弱的是粉单竹。对胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116的增殖抑制作用均较强的竹种是桂竹、唐竹、毛脚龙竹、斑竹和茶竿竹。其他竹种的竹笋蛋白对这2种肿瘤细胞增殖的抑制作用并无呈现出一定的种属特异性规律。

3 结论与讨论

12种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116的体外增殖均具有显著的且强效的抑制作用，即具有抗癌活性。对胃癌细胞株SGC-7901抑制作用最强的是唐竹，其次是桂竹;对结肠癌细胞株HCT-116抑制作用最强的是毛脚龙竹，其次是桂竹;同时对胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116增殖的抑制作用表现均出色的是桂竹、唐竹、毛脚龙竹、斑竹和茶竿竹。

同一种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC-7901和结肠癌细胞株HCT-116的增殖抑制率不完全相同，并与竹笋蛋白的浓度密切相关。在一定浓度范围内，蛋白浓度越高其抑制肿瘤细胞增殖的作用越明显，即竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率成正比，呈现一定的剂量依赖关系。而一些竹笋蛋白，如桂竹、斑竹、唐竹、毛脚龙竹和茶竿竹等在到达一定浓度后其抑制肿瘤细胞的增殖作用趋于平缓。

该研究中竹笋蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116的增殖都具有强效的抑制作用。一般认为，肿瘤药物敏感试验的体外试验结果与体内化疗疗效总符合率达85%[12]，但仍需进一步对竹笋蛋白进行体内的抗肿瘤活性评价以及活性成分分析，确定其有效物质成分。另外，该研究仅仅探讨了这12种竹笋蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和结肠癌细胞HCT-116体外增殖的抑制作用，其对其他癌细胞株的增殖是否具有抑制作用尚不明确，以及其抑制细胞增殖的作用机制也不清楚，后续研究将进一步探讨这些问题。

参考文献

[1]PORRO G，LENTO P，MARCUCCI F，et al.Different cytotoxic activity and intracellular fate of an antiCD5momordin immunotoxin in normal compared to tumour cells[J].Cancer immunology immunotherapy，1995，40（4）：213-218.

[2] 陈元.蓖麻种子毒蛋白的纯化及相关性质的研究[D].郑州：河南大学，2014.

[3] 钱建亚，刘栋，孙怀昌.甘薯糖蛋白功能研究——体外抗肿瘤与Ames实验[J].食品科学，2005，26（12）：216-218.

[4] CHUETHONG J，ODA K，SAKURAI H，et al.Cochinin B，a novel ribosomeinactivating protein from the seeds of Momordica cochinchinensis[J].Biological and pharmaceutical bulletin，2007，30（3）：428-432.

[5] 熊术道，尹丽慧，李景荣，等.苦瓜蛋白抗肿瘤作用及其分子机制[J].中草药，2008，39（3）：408-411.

[6] 李春红，陈岑，夏之宁，等.植物源活性蛋白的药理作用及分析方法研究进展[J].中国中药杂志，2015，40（13）：2508-2517.

[7] WANG H X，NG T B.Dendrocin，a distinctive antifungal protein from bamboo shoots[J].Biochemical and biophysical research communications，2003，307（3）：750-755.

[8] MAEKAWA T，KOSUGE S，SAKAMOTO S，et al.Biochemical characterization of 60S acidic ribosomal P proteins associated with CKII from bamboo shoots and potent inhibitors of their phosphorylation in vitro[J].Biological & pharmaceutical bulletin，1999，22（7）：667-673.

[9] 杨慧敏，吴良如.24种竹笋蛋白对肿瘤细胞增殖的抑制作用[J].竹子學报，2018，37（2）：49-56.

[10] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志：第9卷 第1分册[M].北京：科学出版社，1996.

[11] 李璟.苦瓜蛋白的纯化及其抗肿瘤活性的研究[D].汕头：汕头大学，2002.

[12] 韩锐.肿瘤化学预防及药物治疗[M].北京：北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社，1991：418.