应用RAPD标记检测淮山种质资源的遗传多样性

蔡锦玲 凌永胜 林文磊

摘要 采用RAPD标记对7份德化淮山种质进行遗传多态性和遗传距离分析，并构建聚类图。从63个RAPD引物中筛出31个多态性较好的组合，扩增得到了156个多态性标记。结果表明，7份淮山种质依据遗传距离可分为2类，组间的遗传距离为0.32，其中，大铭薯、泉淮1513和泉淮1547的親缘关系较近，组内的平均遗传距离为0.21，另一类组内的平均遗传距离为0.44。对照田间表型可见，聚类结果相近于传统分类结果。利用RAPD标记能有效地分析淮山的遗传多样性，对杂交优势的利用具有较大的指导意义。

关键词 淮山;种质资源;RAPD;遗传多样性;聚类分析

中图分类号 S 632.1  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）12-0120-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract To analyze the genetic polymorphism and genetic distance of 7 Dehua Dioscorea opposita germplasm by RAPD markers，and build the cluster diagram，31 combinations with good polymorphism were screened out from 63 RAPD primers，and 156 polymorphic markers were amplified.The results showed that 7 D. opposita germplasms could be divided into two groups according to genetic distance，and the genetic distance between groups was 0.32.Among them，Damingshu，Quanhuai 1513 and Quanhuai 1547 were closely related，with an average genetic distance of 0.21 in the group，the mean genetic distance in the other group was 0.44.Compared with the field phenotype，the clustering results were similar to the traditional classification results.The genetic diversity of D. opposita can be effectively analyzed by RAPD markers，which is of great guiding significance for the utilization of hybridization.

Key words Dioscorea opposita Thunb.;Germplasm resources;RAPD;Genetic diversity;Cluster analysis

淮山属于薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb.）的块状根茎，为缠绕性藤本植物[1]，是集医用、养生、保健、食用、饲用于一身的一种高效率经济作物，其肉质鲜美，风味特别，具有滋补脾胃肺肾，增强人体免疫能力，抑制肿瘤细胞生长，抗氧化活性等作用[2]。淮山在我国的栽培历史已有2 000 余年，原产于我国沿海地区及东南亚一带，现今在全国各地均有种植[3]。由于其栽培历史长、地域广，在栽培生产和销售市场上一直存在同名异种和同种异名的状况，使得淮山种质资源的推广与开发更为艰难。目前国内尚未统一淮山“种”以下第一阶梯的分类标准，因此淮山种质资源的鉴别不仅有利于其开发利用，而且可为遗传育种提供理论支撑。

近年来，DNA分子标记技术相继出现，如RAPD、RFLP、SSR以及SNP等，其中随机扩增多态性DNA标记RAPD（random amplified polymorphic DNA）具有操作方便和多态性检测率高等优势，被广泛应用于材料鉴定、系谱亲缘及进化关系的研究[4]。如李明军等[5]优化了山药基因组RAPD分子标记技术方案;华树妹等[6]采用RAPD分子标记分析了福建省34份山药遗传多样性;黄春洪等[7]使用RAPD分子标记技术对国内11个盾叶薯蓣居群的遗传多态性进行了研究;同时国外也报道了利用RAPD分子标记技术构建山药的遗传图谱[8]。笔者拟用RAPD分子标记研究分析7个淮山种质资源的遗传多样性，以期为淮山遗传育种和杂种优势的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选择来自德化的7份淮山种质资源为供试材料，其中德化本土品种2个（下涌薯、大铭薯），新品系5个（

泉淮红皮白肉、泉淮1515、泉淮1517、泉淮1513、泉淮1547）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。参照Saghai-Maroof等[9]方法，采用CTAB小样法提取山药幼叶基因组总DNA。

1.2.2 PCR反应体系。RAPD引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，共合成了63个引物。反应体系参考华树妹等[6]的优化体系进行。采用20 μL PCR体系：模板DNA （20 ng/μL）1 μL，10×Easy Taq Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.4 μL，引物（10 μmol/L）0.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，37 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40个循环;循环结束后在72 ℃的反应条件下延伸10 min。反应终止后4 ℃保存，PCR扩增产物用l %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 标记采集。统计各样本的RAPD扩增条带（有带读1，没有带读0，只读有多态性的标记）。

1.2.4 数据处理。2个样本X与Y之间遗传距离的计算参照Nei等[10]提供的计算公式：GDxy =1-2Nxy/（Nx+Ny），其中，Nxy为样本X与Y所共有的带;Nx为X样本所有的带;Ny为Y样本所有的带[10]。组内平均遗传距离取组内材料间遗传距离的平均值;组间平均遗传距离取不同组间材料遗传距离的平均值;材料平均遗传距离为某一材料与其他所有供试材料遗传距离的平均值。用非加权平均法（UPGMA）构建材料间的聚类图。遗传距离的计算和聚类图的构建采用R软件包[11]。

2 结果与分析

2.1 淮山种质资源分析评价

调查显示，泉淮1517、下涌薯、泉淮1515和泉淮红皮白肉长势旺盛，茎蔓棱翼四棱形，叶片较大、厚纸质，叶柄长，叶基出脉数均为7条，无零余子。泉淮1513、泉淮1547和大铭薯的茎蔓棱翼圆形，叶片中等、薄革质，叶柄较短，有较多椭圆形或长椭圆形的零余子。其中，下涌薯中熟，产量一般，粗多糖等品质成分含量较高，商品性差，中感炭疽病;泉淮红皮白肉中熟，丰产稳产性好，品质成分含量较高，较抗炭疽病;泉淮1515中熟，丰产又稳产，品质成分含量一般，中感炭疽病;泉淮1517中熟，丰产性好但稳产性差，品质成分含量一般，商品性差，中抗炭疽病;大铭薯中晚熟，产量较低，品质成分含量较低，抗炭疽病;泉淮1513中晚熟，产量低，品质成分含量较低，抗炭疽病;泉淮1547中晚熟，丰产稳产性较好，品质成分含量较高，商品率高，抗炭疽病。

2.2 RAPD标记的多态性

从63个RAPD引物中筛选出31个多态性较好的引物对7个淮山种质资源进行分析，片段长度在200～2 000 kb。一共得到156个多态性标记，平均每个引物5.03个，引物扩增出多态性位点最多达10个。表1为31个随机引物的引物编号及序列，图1是RAPD引物A-20电泳结果。

2.3 遗传距离分析

RAPD标记计算的各淮山种质资源之间的平均遗传距离为0.37～0.49，总平均遗传距离为0.45（表2）。依据遗传距离的大小，分为2类，组间的遗传距离为0.32，第一类群的平均遗传距离为0.44， 较第二类群的平均遗传距离（0.21）远，说明第一类群的淮山种质遗传多样性大;其中，泉淮红皮白肉的平均遗传距离0.49为最大，泉淮1547的平均遗传距离最小，仅为0.37，说明泉淮红皮白肉具备较为丰富的遗传变异性。

2.4 聚类分析

应用RAPD分子标记对7份淮山种质资源进行聚类分析，结果显示：下涌薯、泉淮红皮白肉、泉淮1515和泉淮1517品种间具有较大的遗传相似性，聚在了同一类;大铭薯、泉淮1513和泉淮1547的遗传相似性接近，单独成一类。聚类结果和遗传距离的结果相一致，说明通过这两大类群间杂交选育可获得更高的遗传变异。

3 讨论与结论

3.1 讨论

作为研究作物种质资源亲缘关系的一项技術，RAPD标记具有检测容易、灵敏度高、引物无种属界限等特点，因此较其他鉴定技术如同工酶鉴定技术等更为有效。同时，与其他分子生物学检测技术一样，RAPD标记容易受PCR反应体系中各组分浓度以及PCR仪器性能等因素的影响产生假带，稳定性也相对较差。因此，需要摸索其合适的反应条件，并对试验结果反复验证。

该研究通过RAPD方法测定了来源不同的7个淮山种质资源，得到的聚类结果与传统形态学分类结果有一定的一致性。聚类结果将7个淮山种质资源在平均遗传距离指数为0.45处分为A和B共2组，A组中的泉淮红皮白肉和泉淮1517在产量上较下涌薯与泉淮1515高，与聚类分析中显示出的泉淮红皮白肉和泉淮1517遗传距离较远结果相一致;B组中的大铭薯、泉淮1513和泉淮1547在叶形、茎蔓形态和产量等方面相接近，在传统形态学分类上可以分为同一类。可见，供试的7个淮山种质资源遗传亲缘关系与其产量存在一定相关性，详细情况可待进一步研讨。

3.2 结论

RAPD分子标记在淮山的遗传多样性分析中具有较高的多态性，能够帮助研究者在基因组的DNA水平上掌握其多样性，可尝试选择遗传距离较远的亲本进行配组杂交，获得遗传变异丰富的后代材料。该研究结果表明：泉淮红皮白肉与其他供试淮山种质资源存在大的遗传距离，具有较大的遗传变异，通过配组杂交，较容易获得综合性状好的后代材料;而大铭薯、泉淮1513和泉淮1547的遗传多样性较低，应该优先考虑与类群外的亲本材料配组杂交，才能进一步扩大其遗传多态性。

参考文献

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