水酶法提取紫苏籽油脂工艺

袁德成 王 菲 崔新爽 李晓雪 杨逢建

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

紫苏(Perillafrutescens)为一年生唇形科(Labiatae)草本植物，又名荏子、赤苏、红苏等是传统的药用、油用以及香料植物[1]。紫苏浑身是宝，其籽和梗中含有丰富的营养物质，紫苏叶也成为人们餐桌上的美味。近年来，随着人们对紫苏的认知加深，对紫苏中所含有的活性物质以及营养成分的研究成为一大热点。目前，对紫苏的研究集中在其油的营养价值上，例如紫苏油的保健品，以及紫苏油胶囊的开发。紫苏籽油是一种具有高营养的保健食用油。其不饱和脂肪酸以油酸、亚油酸、α-亚麻酸为主，约占脂肪酸总量的90%，其中，α-亚麻酸是紫苏籽油的最主要成分，含量可达58%～71%[2]。

目前，国内外油脂的提取方法主要集中于压榨法、溶剂浸出法[3]及CO2超临界萃取法[4～5]。水酶法[6]具有耗能少，时间短以及毛油品质高等特点，并且提取油脂工艺操作简便，处理条件温和，不会破坏油脂营养物质，能同时得到高质量的毛油和蛋白质，有利于提高油料作物资源综合利用率。本试验采用水酶法从紫苏籽中提取油脂，水酶法在提取油脂的同时能高效的回收油料中其他价值组分，被油脂科学界称为“一种油料资源的全利用技术”。与传统工艺相比，其在能耗、环境和安全卫生等方面具有显著优势。通过单因素试验的筛选，确定条件范围，借助于响应面分析法求得回归方程，可以准确的确定试验因素之间的交互作用在工艺过程中对指标响应值的影响，且试验具有周期短、精度高等优点。通过响应面[7]优化分析得到最佳工艺，为生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏籽购买于黑龙江省伊春市林业局，种粒饱满干燥无霉变；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶购买于上海源叶生物科技有限公司；正己烷、甲醇均为分析纯，购买于南京百伦斯贸易实业有限公司。

1.2 仪器与设备

BJ-800A中药粉碎机；TB-215D型电子天；TGL-20M台式高速冷冻离心机；安捷伦GC7890气相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 理化指标的测定

过氧化值测定：采用GB/T 5538-2005《动植物油脂过氧化值测定》[8]；酸值测定：采用GB/T 5530-2005《动植物油脂酸值和酸度测定》[9]；皂化值测定：采用GB/T 5534-2008《动植物油脂皂化值的测定》[10]；碘值的测定：采用GB/T 5532-2008《动植物油脂碘值的测定》[11]；水分及挥发物的测定：采用BG/T 5528-2008《动植物油脂水分及挥发物含量测定》[12]；折光指数的测定：采用GB/T 5527-2010《动植物油脂折光指数的测定》[13]；相对密度的测定：采用GB/T 5518-2008《油粮检测粮食、油料相对密度的测定》[14]；不饱和脂肪酸检测：气相色谱仪。

1.3.2 工艺流程

紫苏种子用粉碎机破碎10 s，准确称取10 g的紫苏籽粉，加入一定比例水搅拌均匀后，用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl溶液调节pH，450 r·min-1适当温度水浴搅拌一定时间后，加热90℃保持10 min，然后11 000 r·min-1高速离心15 min，分离得到清油Ⅰ、乳状液、水解液、残渣Ⅰ。乳状液采用冷冻破乳方式，得到清油Ⅱ及残渣Ⅱ。收集残渣Ⅰ及残渣Ⅱ；将残渣70℃烘干。

油提取率采用下式计算：

1.4 紫苏籽油提取单因素试验

对水酶法提取的酶解温度、pH、液固比、加酶量、酶解时间分别进行单因素试验，考察这5个因素对紫苏籽油脂提取率的影响。

1.4.1 酶解温度的影响

pH9.5，液固比5∶1，加酶量1.5%，酶解时间5h，酶解温度分别为40、45、50、55和60℃，试验重复3次。

1.4.2 pH的影响

酶解温度55℃，液固比5∶1，加酶量1.5%，酶解时间5 h，pH分别为pH7.5、8、8.5、9、9.5、10和10.5，试验重复3次。

1.4.3 液固比的影响

酶解温度55℃，pH9.5，加酶量1.5%，酶解时间5 h，液固比分别为3∶1，5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，试验重复3次。

1.4.4 加酶量的影响

酶解温度55℃，pH9.5，液固比5∶1，酶解时间5 h，加酶量分别为0、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%，试验重复3次。

1.4.5 酶解时间的影响

酶解温度55℃，pH9.5，液固比5∶1，加酶量1.5%，酶解时间分别为1、2、3、4、5、6、7 h，试验重复3次。

1.5 紫苏籽油提取的中心组合设计—响应面法优化

由单因素试验选出对紫苏籽油脂提取最显著的4个因素及变化范围：液固比范围是4∶1～6∶1，加酶量范围是1.25%～1.75%，酶解温度范围是52.5～57.5℃，酶解时间范围是3.75～5.25 h，以油脂提取率为响应值进行中心组合试验设计，中心组合设计因素详见表1，并依据表2进行30次试验。

表1 紫苏籽油脂提取工艺中心组合设计的因素与水平

Table 1 Factors and levels of center combined design ofPerillaseed oil extraction process

编码水平Coding level因素FactorsX1液固比Solid-liquid ratio(g·mL-1)X2加酶量Enzyme added(%)X3温度Temperature(℃)X4时间Time(h)-α31503-141.2552.53.75051.5554.5161.7557.55.25+α72606

2 结果与分析

2.1 酶种类的筛选

水酶法提油的原理是通过酶分解植物油料中富含粗纤维的细胞壁、脂蛋白、脂多糖，从而使油释放出来，酶的选择在水酶法工艺中至关重要，不同酶对紫苏籽油提取的效果存在很大差异。由图1可知，其中碱性蛋白酶效果最好提取率为30.5%，其次是中性蛋白酶，无酶和果胶酶效果最差。碱性蛋白酶的高提取率一方面可能是由于其性质更容易与紫苏籽蛋白发生相互作用，另一方面碱性蛋白酶的最适提取条件是在碱性环境下进行的，高pH能增大蛋白的水解度，更有利于油脂的释放。碱性蛋白酶的最适pH为9.5，远离紫苏籽蛋白等电点，可以很好的酶解蛋白，使油料细胞的结构破坏，以至于油游离出来[15]。油脂在与氢氧化钠发生皂化反应时，1 g油脂需消耗0.15 g氢氧化钠，配制pH溶液所需要的氢氧化钠是特别微量的，所以不会发生油脂的皂化反应，且碱性蛋白酶效果显著，因此选用碱性蛋白酶做为提取工艺的酶制剂。

图1 酶种类对紫苏籽油提取率的影响 1.无酶；2.中性蛋白酶；3.淀粉酶；4.果胶酶；5.胰蛋白酶；6.碱性蛋白酶；7.木瓜蛋白酶Fig.1 Effect of enzymes on Perilla seed oil extraction1.Enzyme free；2.Neutral protease；3.Amylase；4.Pectinase；5.Trypsin；6.Alkaline protease；7.Papain

图2 酶解pH值对紫苏籽油提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis pH on Perilla seed oil extraction

图3 酶解温度对紫苏籽油提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on Perilla seed oil extraction rate

图4 液固比对紫苏籽油提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of Perilla seed oil

2.2 pH值的确定

选用碱性蛋白酶，在液(mL)固(g)比5∶1、加酶量1.5%、酶解时间5 h、温度55℃的条件下，考察pH值对紫苏籽油提取率的影响。碱性蛋白酶的pH范围是9.0～10.5，由图2可以得出，pH在9、9.5、10时提取率分别为：31.11%、31.62%、30.19%，在这个范围内pH值对油提取率基本没有影响，所以CCD中心组合设计pH值因素固定，选用pH值为9.5。

2.3 紫苏籽油脂工艺提取的单因素试验结果

本试验选用碱性蛋白酶为水酶法提取紫苏籽油酶制剂，固定pH值为9.5，考察液(mL)固(g)、加酶量、酶解时间及温度的单因素对紫苏籽油提取率的影响。

2.3.1 酶解温度对紫苏籽油提取率的影响

在液(mL)固(g)比5∶1、加酶量1.5%、酶解时间为5 h的条件下酶解温度在50～55℃范围时，提取率上升趋势明显，并且在55℃时达到最高30.66%，超过55℃时呈下降趋势，因此选用酶解温度为55℃(图3)。

2.3.2 液固比对紫苏籽油提取率的影响

在酶解温度为55℃、加酶量1.5%、酶解时间为5 h的条件下，液固比在3∶1～5∶1范围时，提取率上升趋势明显，随着液固比增大提取率变化并不明显，液固比过大，酶解浓度在整个体系中降低，底物与酶相互接触的机会减少，影响反应速度，因此选用液(mL)固(g)比为5∶1(图4)。

图5 加酶量对紫苏籽油提取率的影响Fig.5 Effect of enzyme addition on Perilla seed oil extraction rate

2.3.3 加酶量对紫苏籽油提取率的影响

在酶解温度为55℃、液(mL)固(g)比5∶1、酶解时间为5 h的条件下，随着加酶量的增加，提油率呈上升趋势，为正相关。加酶量0～0.5%范围急剧升高，在加酶量达到1.5%时开始趋于平缓，酶量的增加提高了整个体系的反应效果，增加到一定量时底物与酶作用达到饱和，考虑经济成本因素，本试验选用加酶量为1.5%(图5)。

2.3.4 酶解时间对紫苏籽油提取率的影响

在酶解温度为55℃、液(mL)固(g)比5∶1、加酶量1.5%的条件下，随着酶解时间的延长，油提取率逐渐增加，在5 h时达到最高33.6%，再延长时间底物减少，与酶相互作用效果降低，油提率不再随时间延长而提高，同时时间过长会使油脂中的不饱和脂肪酸发生氧化，降低油脂品质[16]。因此本试验选用5 h为酶作用时间(图6)。

图6 酶解时间对紫苏籽油提取率的影响Fig.6 The effect of enzymolysis time on the extraction rate of Perilla seed oil

2.4 紫苏籽油提取工艺的中心组合设计—响应面分析

在单因素试验基础上建立对紫苏籽油水酶法提取工艺的参数进行响应面分析，其中心组合设计试验结果见表2。

表2 紫苏籽油提取工艺中心组合试验设计与结果

Table 2Perillaseed oil extraction technology center combination test design and results

试验号Test number水平LevelX1X2(%)X3(℃)X4(h)提取率Extraction rate(%)141.7552.53.7529.29241.2557.55.2532.03361.2552.53.7530.50471.5055.04.5032.63551.5055.06.0032.55651.5050.04.5028.38761.7552.55.2530.26831.5055.04.5028.87961.7557.53.7533.691061.2557.55.2532.661151.0055.04.5030.461251.5055.04.5031.551351.5055.04.5030.961441.7557.55.2532.951551.5055.04.5032.001661.7557.55.2535.491741.2552.53.7529.421841.7557.53.7530.911941.2552.55.2529.942051.5055.03.0029.222161.2552.55.2531.462252.0055.04.5031.042351.5055.04.5031.772441.2557.53.7530.392551.5055.04.5031.492651.5055.04.5032.552761.2557.53.7531.232841.7552.55.2531.912961.7552.53.7531.663051.5060.04.5035.18

表3 回归模型系数及显著性检验结果

Table 3 Regression model coefficients and significance test results

来源Source平方和ss自由度df均方msF值F-valuePr>FP-value模型Model61.85415.4620.05<0.0001X112.98112.9816.830.0004X23.9013.905.050.0337X333.92133.9243.98<0.0001X411.06111.0614.340.0009残差Residual19.28250.77失拟项Lack of fit17.85200.893.120.1051纯误差Pure error1.4350.29总差Cor total81.1329R20.7624R2Adi0.7243

图7残差分布近似于直线，试验值多集中在残差为0附近，并且直线两端数值稀少，说明试验与残差服从正态分布，从而反映该模型具有可靠性。

如图8所示，依据紫苏籽油提取率的回归模型做出其等高线及响应面图，可以直观地反映试验条件对油提取率的影响，响应面变化越陡表示对试验结果的影响越显著[19]。结合图形分析：响应面图形变化较陡，说明变化是均匀的，对提取率影响显著[20]。

图7 残差正态概率分布Fig.7 Residual normal probability distribution

图8 响应面各因素之间相互作用立体图Fig.8 Response surface interactions

2.5 最佳试验条件的确定与验证

通过Design Expert 8.0.6响应面优化软件分析预测油提取率最佳条件为碱性蛋白酶在pH9.5条件下液(mL)固(g)比9.97∶1、加酶量2.75%、温度56.1℃、时间5.25 h，进行3次平行试验，紫苏油平均提取率结果为37.65%，与理论值38.3%十分接近，表明此模型可用。

2.6 紫苏籽油理化性质分析

不同提取方式的紫苏籽油脂理化指标见表4，由表4可以看出水酶法提取的紫苏籽各项指标均符合国家标准，表明试验方法可行。

表4 紫苏籽油的理化性质

图9 水酶法提取紫苏籽油总离子流图 1.棕榈酸(C16∶0)；2.硬脂酸(C18∶0)；3.油脂酸(C18∶1)；4.亚油酸(C18∶2)；5.α-亚麻酸(C18∶3) 下同。Fig.9 Aqueous enzymatic extraction of Perilla seed oil total ion current map 1.Palmitic acid(C16∶0)；2.Stearic acid(C18∶0)；3.Fatty acid(C18∶1)；4.Linoleic acid(C18∶2)；5.Alpha linolenic acid(C18∶3) The same as below.

图10 溶剂法提取紫苏籽油总离子流图Fig.10 Total ion flow diagram of Perilla seed oil extracted by solvent method

图11 压榨法提取紫苏籽油总离子流图Fig.11 Total ion flow chart of Perilla seed oil extracted by pressing method

紫苏种子脂肪酸主要由5种成分组成，按出峰顺序依次为棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油脂酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、α-亚麻酸(C18∶3)其中油酸、亚油酸和α-亚麻酸为不饱和脂肪酸。通过气相色谱仪对紫苏种子脂肪酸组成进行分析，在总脂肪酸中，水酶法提取的紫苏油脂中棕榈酸(C16∶0)占7.1%，硬脂酸(C18∶0)占2.64%、油脂酸(C18∶1)9.95%，亚油酸(C18∶2)占13.06%，α-亚麻酸(C18∶3)占67.9%，溶剂法和冷榨法提取的油脂中α-亚麻酸含量分别为66.33%、67.26%，不及水酶法提取的相对含量高。

3 结论

最佳提取工艺参数碱性蛋白酶在pH9.5条件下液(mL)固(g)比9.97∶1、加酶量2.75%、温度56.1℃、时间5.25 h，该条件下紫苏油脂的提取率可达到37.65%，接近理论值38.3%，说明建立的模型合理有效。此工艺得出油脂的理化指标较好，且具有提取率高、时间短、耗能少等优点，为紫苏籽油的高效、简便的工业化生产提供了可能，也为紫苏籽有效的利用奠定了基础。